Cell | 细胞黏着斑关键蛋白Talin1冷冻电镜结构揭示其自抑制原理

黏着斑（Focal adhesions， FAs）在细胞黏附、迁移和分化等生命过程中发挥着重要作用，由大量胞内蛋白协调装配形成。细胞通过感知环境压力，对外可以通过FAs将细胞锚定到胞外基质，而在胞内FAs能够调节胞内蛋白的组成形式，实时调节细胞功能和改变细胞形态。FAs可直接与细胞膜上的整合蛋白（Integrin）互作，在可迁移细胞中，整合蛋白激活起始FAs的形成，而其失活将导致FAs解装配，使细胞不再固定，循环往复实现细胞的迁移。Talin是FAs的重要组成，负责激活整合蛋白、调节胞内胞外的信号传递，同时Talin还是一个机械力感受器，Talin的激活和失活在FAs的动态变化过程中发挥了重要的调节作用。Talin的激活状态已有大量研究，但抑制状态的工作还很不细致，因此抑制状态结构的解析对于理解Talin的调控方式具有重要意义。

近日，德国马克斯·普朗克生物化学研究所（Max Planck Institute of Biochemistry）Naoko Mizuno团队在Cell 杂志上发表了由题为The Architecture of Talin1 Reveals anAutoinhibition Mechanism的文章，报道了Talin1全长处于抑制状态的冷冻电镜结构，发现Talin单体中，Rod结构域折叠排列成15nm的球状结构，连结FERM结构域，该构象下R9和R12阻碍了整合蛋白和磷脂PIP2结合FERM结构域，而整合蛋白的结合位点被深埋入自抑制状态的口袋中，同时Rod结构域的关闭导致黏着斑蛋白不能结合以及肌动蛋白通过结合位点2（ABS2）的结合。这种自抑制的机制可能实现了同时阻止整合蛋白，细胞膜和细胞骨架结合。他们还发现抑制状态紧密折叠的Talin1可以重新解折叠成60nm长的细丝构象，暴露出可与黏着斑蛋白和肌动蛋白相互作用的位点。这一工作为理解Talin功能发挥的调控机制提供了结构生物学基础。

Talin是一个由18个结构域组成的270kDa的蛋白，包括50kDa的球形结构域（FERM）、63个螺旋组成的棒状结构域（Rod）、以及羧基端（DD）。Talin具有类似弹簧的独特构象变化，当Talin被激活后，呈现出60-100nm的棒状结构，可以结合多种FA蛋白，其中FERM结构域包含了整合蛋白结合位点IBS1和PIPI2的识别位点。

Talin分别处于打开和关闭构象的原理示意图

Talin冷冻电镜结构的密度图和PDB示意图

Talin整体分辨率达到5.5-6.2 Å，不过F0-F1和DD的密度缺失，R11-R13的密度不好，R3通过局部refine后密度有所提升，说明这些区域在该自抑制状态下构象并不均一，其中F0-F1和F2-F3间有一段较长的linker，F0-F1在生理条件下可能处于动态变化的过程，DD截短突变的Talin-DD也能处于抑制构象，暗示DD可能不参与抑制；每一个单独结构域的晶体或NMR结构均已得到解析，用于全长结构的模型搭建。

Talin的抑制构象同时阻止整合蛋白，细胞膜上磷脂的结合。该抑制结构是单体，而DD结构域的晶体是coiled-coil的二聚形式，通过梯度戊二醛交联（GraFix）发现，全长的Talin有更高分子量的交联条带，而DD截短的Talin没有出现交联的条带，也说明了DD结构域能够形成二聚，与之前的实验数据吻合，但单体即能够实现自抑制。

在探究Talin的调控机制时，研究者发现随着盐浓度升高，Talin从关闭构象逐渐变为伸展的开放构象，并且该构象变化是可逆的；在生理盐浓度下，81%的Talin处于关闭的构象。随后通过对一些关键的相互作用位点进行点突变来改变带电，最终实现在75mM盐浓度条件下实现均处于关闭构象。研究者据此推测，Rod结构域可以在这种弱电荷相互作用的基础上形成紧密折叠的关闭构象，也可以快速响应盐浓度变化实现构象改变。

研究者发现开放构象下Talin和黏着斑蛋白1：1结合，但关闭构象下Talin不结和黏着斑蛋白，黏着斑蛋白尾部结构与Talin的R3结构域竞争性结合黏着斑蛋白的头部结构。

肌动蛋白位于黏着斑的基部，通过与Talin的ABS2和ABS3结合激活Talin。从Talin和肌动蛋白的结合实验结果推测，R12的位置变化使得肌动蛋白可以结合ABS2以及黏着斑蛋白的结合。

研究者基于结构和功能的实验结果提出了如下模型：

最后研究者也提出了一些有待解决的问题，比如更高分辨率结构的解析以揭示不同螺旋或结构域间相互作用，蛋白结合抑制状态下Talin的复合体的结构。

总的来说，研究者揭示了抑制状态下的Talin的冷冻电镜结构，回答了Talin调控的分子机制并提出了由抑制到激活状态的工作模型。