【人物与科研】华东理工大学杨友教授课题组：幽门螺旋杆菌表面含有D-甘油-D-甘露庚糖的三糖抗原的全合成及免疫活性评价
导语
幽门螺旋杆菌是导致慢性胃炎，消化性溃疡和胃癌的最常见病原体，它感染了全球大约一半的人口，对人类的健康造成了重大威胁。由于抗生素耐药性增加和患者的依从性差，基于抗生素的三联或四联疗法越来越难以根除幽门螺旋杆菌。因此，发展经济高效的亚单位疫苗对于控制幽门螺旋杆菌感染非常具有吸引力，但尚无有效的市场化疫苗可预防幽门螺旋杆菌感染。近日，华东理工大学杨友教授课题组开发了一种从头合成方法制备D-甘油-D-甘露庚糖砌块，完成了幽门螺旋杆菌血清型O3和O6以及菌株MO19、D2、D4和D5表面脂多糖中独特的含有α-(1→3)-连接的D-甘油-D-甘露庚糖的三糖抗原的全合成。并且，他们发现用该三糖所制备的糖缀合物免疫小鼠后会引起非常强大的T细胞依赖性抗原特异性免疫反应，产生高滴度的IgG1和IgG2b保护性抗体，免疫后的血清可识别幽门螺旋杆菌NCTC 11637，并与完整细菌的表面牢固结合（ DOI: 10.1021/acs.orglett.0c03105）。
杨友教授课题组简介
华东理工大学杨友教授课题组成立于2014年9月。课题组主要研究方向为：（1）具有重要生理活性的糖及糖缀合物的合成方法学、全合成和化学生物学；（2）糖类药物和糖类疫苗的开发；（3）糖与蛋白质相互作用机理的研究及其在新型医疗诊断工具中的应用。课题组现有博士生5名，硕士生14名。课题组长期招收博士后和研究助理，热忱欢迎有志于糖化学和糖类药物研究的学生加入杨友教授的研究团队，共同在糖科学领域进行探索。
杨友教授简介
杨友，华东理工大学教授，博士生导师，国家级青年人才。2004年毕业于中国科学技术大学化学系，获理学学士学位。随后由中国科学技术大学和中国科学院上海有机化学研究所联合培养，于2010年获中国科学技术大学理学博士学位。2010年8月至2014年6月，在德国马克斯–普朗克胶体与界面研究所进行博士后研究。2014年9月至今，历任华东理工大学药学院副教授、教授、博士生导师。中国化学会糖化学专业委员会委员。主要从事糖化学和糖类药物的研究。在Chem. Rev., J. Am. Chem. Soc., Org. Lett.等学术刊物上发表论文40余篇。获得国家级青年人才，上海市浦江人才，中国药学会-施维雅青年药物化学奖，华东理工大学“青年英才校长奖”等荣誉和奖励。
前沿科研成果
幽门螺旋杆菌表面含有D-甘油-D-甘露庚糖的三糖抗原的全合成及免疫活性评价
幽门螺旋杆菌是一种螺旋形革兰氏阴性细菌病原体，是导致慢性胃炎、消化性溃疡和胃癌的主要原因，对人类健康构成了重大威胁。由于抗生素耐药性增加和患者依从性差，使用抗生素联合疗法用于幽门螺旋杆菌的治疗变得越来越困难。因此，研制一种经济、高效、安全的疫苗对于控制幽门螺旋杆菌感染具有很高的经济社会价值。然而，目前还没有针对幽门螺旋杆菌的有效疫苗上市。
为了开发抗幽门螺旋杆菌感染的糖类疫苗，已有研究者从幽门螺旋杆菌中分离出细胞表面脂多糖片段，并将其与载体蛋白偶联，证明所得糖缀合物具有作为潜在疫苗候选物的价值。为了阐明幽门螺旋杆菌脂多糖的构效关系和最小抗原表位，对脂多糖片段进行化学合成是非常必要的。一些研究结果表明，结构独特的α-(1→3)连接的D-甘油-D-甘露庚糖存在于幽门螺旋杆菌多种菌株的O-抗原和核心结构之间的间隔区，有潜力成为抗幽门螺旋杆菌糖类疫苗的关键单元。然而，使用α-(1→3)连接的D-甘油-D-甘露庚糖作为碳水化合物表位，将其所制备的糖缀合物对动物进行主动免疫所产生的免疫反应和抗体功能仍不清楚。
与传统同系化策略制备D-甘油-D-甘露庚糖砌块相比，从头合成方法是制备稀有庚糖砌块的一种有效替代策略，避免了同系化策略中进行双键的双羟基化反应时经常使用的高毒性锇盐。近日，杨友教授课题组开发了一种从头合成方法制备D-甘油-D-甘露庚糖砌块，完成了幽门螺旋杆菌血清型O3和O6以及菌株MO19、D2、D4和D5表面含有α-(1→3)-连接的D-甘油-D-甘露庚糖的三糖抗原的全合成。利用所制备的糖缀合物注射小鼠后，发现所产生的IgG抗体能与完整的幽门螺旋杆菌细菌显著结合，表明含有α-(1→3)连接的D-甘油-D-甘露庚糖的三糖抗原在抗幽门螺旋杆菌疫苗的开发中具有很好的应用前景。
含有α-(1→3)连接的D-甘油-D-甘露庚糖的三糖抗原1是幽门螺旋杆菌血清型O3和O6以及菌株MO19、D2、D4和D5脂多糖中共存的重复单元，也可能是其最小表位。为了产生T细胞依赖性的免疫应答，其还原端被设计安装上五碳氨基连接臂，以便于与载体蛋白结合（图1）。
图1. 幽门螺旋杆菌血清型O3和O6以及菌株MO19、D2、D4和D5脂多糖中共存三糖抗原1的逆合成分析
（来源：Org. Lett.）
基于逆合成分析，三糖1可以由邻炔基苯甲酸酯给体2和3位羟基裸露的庚糖受体3来制备。砌块2和3的2位乙酰基可通过邻基参与效应确保庚糖之间1,2-反式-α-糖苷键的形成，砌块2的3位Lev基团作为生成相应3-羟基受体的临时保护基团。砌块2和3将通过从头合成路线从简单原料4-6获得。
图2. D-甘油-D-甘露庚糖砌块2和3的从头合成
（来源：Org. Lett.）
作者首先从三碳酮4出发，在L-脯氨酸的催化下与醛5发生aldol反应，随后对羰基进行选择性还原，得到二醇7（图2）。对二醇7的两个羟基进行苄基保护得到化合物8之后，脱除其3,5位的丙叉生成二醇，接着用TBDPSCl和TBSCl分别保护伯羟基和仲羟基，通过三步反应以89%的产率得到二甲基缩醛9。在丙酮中用催化量的对甲苯磺酸将化合物9顺利水解得到醛10，随后与烯酮缩醛 6进行Mukaiyama aldol反应，以优秀的非对映选择性得到七碳骨架11，两步收率为72%。
由于三氟乙酸会导致11中TBS基团的部分脱除，所以作者选用氟化氢吡啶的四氢呋喃体系脱除11中的所有硅基保护基，并诱导其内酯化得到相应的三醇，再用TBDPSCl选择性保护三醇的伯羟基得到二醇12。
将化合物12用原酸酯和催化量的对甲苯磺酸对两个邻位羟基进行保护，并用LiAlH(OtBu)3对异头位内酯进行还原，得到相应的半缩醛。随后，在EDCI和DMAP的活化下与邻炔基苯甲酸缩合，在酸性条件对原酸酯选择性开环后得到化合物13。将13中的3-羟基用Lev保护基保护后以94%的收率得到α-构型邻炔基苯甲酸酯给体2。
将化合物2与五碳连接臂14进行糖苷化反应，以Ph3PAuOTf (0.1 eq.)作为促进剂，加入TfOH (0.1 eq.)以防止相应原酸酯的形成，以92%的收率得到α-构型庚糖苷15。使用醋酸肼·吡啶选择性脱除15中的Lev基团得到3位羟基裸露的庚糖受体3。
图3. 幽门螺旋杆菌血清型O3和O6以及菌株MO19、D2、D4和D5
脂多糖中三糖抗原1的合成
（来源：Org. Lett.）
得到砌块2和3后，开始组装三糖抗原1（图3）。作者使用PPh3AuOTf (0.1 eq.)和TfOH (0.1 eq.)催化给体2和受体3的糖苷化反应，以71% 的收率得到α-(1→3)-连接的二糖16。继续采用类似的策略，脱除16中的Lev基团得到二糖受体17。在相似的活化条件下，邻炔基苯甲酸酯2与17发生糖苷化反应，以中等收率得到了所需的α-(1→3)连接的三糖18。随后，通过氟化氢吡啶脱除18的硅基保护基团，用皂化反应脱除酯基，氢化反应脱除所有苄基，最终得到目标三糖1。
图4. CRM197–1糖缀合物的制备和表征
（来源：Org. Lett.）
为了诱导T细胞依赖的保护性免疫应答，作者首先将三糖1与载体蛋白CRM197偶联，用不影响糖缀合物免疫学活性的双琥珀酰亚胺戊二酸酯作为双功能连接臂，将三糖1转化为相应的活化单酯，再与CRM197共价偶联，得到CRM197−1糖缀合物（图4）。对CRM197和CRM197-1糖缀合物进行了MALDI-TOF分析，发现每个CRM197-1糖缀合物平均含有4.4个三糖1分子。通过对CRM197−1糖缀合物和CRM197的SDS−PAGE分析，也证实了CRM197−1糖缀合物的载糖量。此外，作者还将三糖1与人血清白蛋白（HSA）偶联，得到HSA−1糖缀合物，用作ELISA检测碳水化合物抗原特异性抗体的捕捉剂。
图5. ELISA分析CRM197-1糖缀合物免疫的小鼠血清中的抗体滴度
（来源：Org. Lett.）
接着，作者用弗氏佐剂（FA）配制的CRM197−1糖缀合物和单独CRM197−1糖缀合物皮下注射雌性C57BL/6J小鼠，评价CRM197-1糖缀合物的免疫应答（图5）。在第0天的初次免疫后，小鼠在第14天和第28天接受了两次加强免疫。以HSA-1糖缀合物为捕捉剂，用ELISA法检测免疫后血清中与免疫应答相关的抗体效价。ELISA数据表明，在第35天，用FA配制的CRM197-1糖缀合物免疫的小鼠产生了非常高滴度的IgG抗原特异性抗体，而单独用该糖缀合物处理的小鼠产生了很弱的免疫反应。对照组小鼠的血清与捕捉剂没有明显的结合。对CRM197-1与FA联合免疫的小鼠第35天血清的抗体亚型分析表明，免疫小鼠产生了高滴度的IgG1、IgG2b和IgG3抗体，而IgG2a抗体水平较低。与CRM197−1糖缀合物与FA联合免疫的小鼠相比，单独接种CRM197−1糖缀合物的小鼠产生了低滴度的IgM和IgG亚型。抗原特异性抗体的类别转换，特别是通常被认为是保护性抗体亚型的高滴度的IgG1和IgG2b抗体，表明用FA配制的CRM197−1糖缀合物诱导了强烈的T细胞依赖性保护性免疫反应。
图6. 紫外线灭活的幽门螺旋杆菌NCTC 11637的免疫荧光染色
（来源：Org. Lett.）
然后，作者为了探讨免疫小鼠产生的血清是否能识别完整幽门螺旋杆菌表面的脂多糖，用免疫荧光法检测了第35天血清与紫外线灭活的幽门螺旋杆菌NCTC 11637的结合情况(图6)。在异硫氰酸荧光素（FITC）标记的羊抗鼠IgG抗体（绿色）染色的基础上，用激光扫描共聚焦显微镜进行细菌标记。以未经血清处理的细菌和加未经疫苗处理的小鼠血清的细菌作为对照。用FA配制的CRM197-1糖缀合物免疫的小鼠的免疫后血清显示与幽门螺旋杆菌NCTC 11637显著结合，表明针对合成三糖1产生的抗体可以识别该细菌脂多糖的D-甘油-D-甘露庚糖单元。这些结果表明，CRM197-1糖缀合物诱导产生了可与幽门螺旋杆菌表面脂多糖中D-甘油-D-甘露庚糖残基结合的交叉反应抗体。此外，通过对流式细胞术实验数据的分析，也证实了CRM197-1与FA联合免疫的小鼠免疫后血清与紫外线灭活的幽门螺旋杆菌NCTC 11637的结合能力。结果表明，抗CRM197−1糖缀合物的抗体强烈结合在该完整细菌的表面。因此，CRM197−1糖缀合物与FA联合免疫可激发出针对幽门螺旋杆菌的抗体介导的交叉反应的保护性免疫。
总结：杨友教授课题组描述了一种从头合成方法获得D-甘油-D-甘露庚糖砌块，并将其应用于幽门螺旋杆菌血清型O3和O6以及菌株MO19、D2、D4和D5脂多糖中独特的含有α-(1→3)-连接的D-甘油-D-甘露庚糖的三糖抗原1的全合成中。利用FA配制的CRM197-1糖缀合物免疫小鼠后，发现可诱导产生极高滴度的抗原特异性抗体。特别是IgG1和IgG2b抗体的高水平表达，表明产生了强大的T细胞依赖性保护性免疫反应。基于免疫荧光染色和流式细胞术实验，发现免疫后血清与幽门螺旋杆菌NCTC 11637表面显著结合，表明产生的抗体与其他幽门螺旋杆菌菌株有交叉反应。CRM197−1糖缀合物作为幽门螺旋杆菌候选疫苗的进一步评价工作目前正在进行中。
该项研究成果近期发表于Organic Letters（ DOI: 10.1021/acs.orglett.0c03105），研究生王骏畅和张依玥是该文章的共同第一作者，杨友教授为通讯作者。上述研究工作得到了国家自然科学基金、中央高校基本科研业务费专项资金等的资助。
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