小分子诱导的聚合促进BCL6的泛素化降解

科技工作者之家 11月19日

来源:BioArt

小分子诱导的蛋白降解已成为一种很效的治疗策略,如一些沙利度胺类药物可调节CUL4-RBX1-DDB1-CRBN(CRL4CRBN)E3泛素连接酶的活性,招募和泛素化IKZF1、IKZF3和CK1α,从而导致其蛋白酶体降解【1】。其他小分子如异源双功能降解剂也已被开发出来用以降解包括激酶、核受体等多个临床靶点,这些小分子降解剂同时作用于E3连接酶和靶蛋白,促进形成底物-药物-连接酶复合物【2】。但目前发现一些蛋白质(如BCL6)对于异源双功能降解剂具有一定的抵抗能力【3】

BCL6是一个有前途的药物靶点,用于非霍奇金淋巴瘤,包括弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)和滤泡性淋巴瘤等。病理上BCL6的表达增加是由于易位、外显子突变、启动子突变等,这也是B细胞恶性肿瘤的常见原因【4】。虽然在体外已发现在淋巴瘤细胞中敲除BCL6会导致肿瘤停滞,但在体内,几种靶向BCL6的多肽和小分子抑制剂仅在高浓度具有效果,这大大限制了临床转化力【5】

此前已发现小分子BI-3802可以与BCL6的BTB结构域结合,诱导BCL6的降解,经BI-3802处理可诱导BCL6快速泛素化和降解,在DLBCL细胞系中具有抗增殖作用,且效果与基因敲除相当,远优于其他抑制剂或降解剂【6,7】

为了揭示BI-3802的作用机制,2020年11月18日,哈佛医学院丹娜法伯癌症研究院Benjamin Ebert和Eric Fischer团队在Nature上在线了题为“Small-molecule-induced polymerization triggers degradation of BCL6”的研究论文,阐述了BI-3802降解BCL6的具体机制,通过结合BCL6的BTB区域,与BCL6同源二聚体结合形成超分子结构,促进SIAH1 E3泛素连接酶的泛素化作用,从而高效诱导BCL6蛋白酶体降解,为临床治疗开辟了新的途径。wt_a32302021119211815_716fde.jpg

研究人员首先利用定量质谱检测BI-3802处理过的DLBCL细胞系SuDHL4细胞的蛋白组,BCL6蛋白表达显著减少,RNA水平则没有变化。随后利用BCL6荧光报告系统,在HEK293T细胞中检测BI-3802处理后的荧光变化情况,同样得到BI-3802可以有BCL6蛋白降解的结论,并且这种作用可以被26S蛋白酶体和MG132以及泛素激酶UBA1和MLN7243(而不是类泛素化neddylation通路)所减弱。接着,研究人员利用活细胞荧光显微镜和免疫荧光来检测BI-3802处理后的eGFP-BCL6融合蛋白的定位,发现BI-3802可以诱导BCL6全长和仅包含BTB区域的构建体的病灶,eGFP信号和病灶随后消失,与BCL6降解一致。以上结果说明BI-3802能诱导BCL6的选择性降解和细胞内BCL6病灶,该过程依赖于非cullin E3泛素连接酶和BCL6的BTB区域。

进一步,研究人员对BCL6病灶形成的分子基础展开探索,利用负染电子显微镜在体外发现BCL6与BI-3802共孵育后会形成规律的正弦曲线形结构,进一步建立丝状模型,研究人员发现两个BCL6 BTB两个二聚体与BI-3802的两个分子在界面上对称关联时才会产生类似与负染电镜观察到的螺旋超结构。进一步低温电镜确认了BI-3802诱导的BCL6的丝状结构,揭示了BCL6二聚体的特征。而将二聚体-二聚体至关重要的氨基酸残基突变后则会破坏药物诱导的聚合作用。进一步评估对BI-3802活性有贡献的氨基酸位点,研究人员发现E41、G55、Y58和C84对多聚化和药物结合至关重要。以上结果表明,BI-3802可以诱导BCL6的聚合,阻断BCL6的聚合会损害淋巴瘤细胞的病灶形成、BCL6降解以及BI-3802的细胞毒性。

最后,研究人员研究了BI-3802诱导BCL6降解的机制,通过CRISPR-Cas9筛选发现了非cullin E3泛素连接酶SIAH1,多个独立靶向SIAH1的sgRNA均能减弱BI-3802导致的BCL6降解,同样,过表达SIAH1则会增强降解。进一步,研究人员通过体外免疫共沉淀和泛素化实验,证明了BCL6氨基酸残基249-251的VxP域对SIAH1的作用至关重要。时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)实验展示了BI-3802能够增强BCL6和SIAH1之间的相互作用,以上研究共同表明,在BI-3802的存在下,SIAH1以Vx域依赖的方式被定位到BCL6病灶,BI-3802诱导的聚合增强了BCL6和SIAH1之间的相互作用,并使BCL6泛素化加速降解。

综上所述,通过功能筛选、生化分析和结构表征,研究人员证明了BI-3802与BCL6的BTB域结合诱导BCL6的聚合,促进BCL6被SIAH1通过结合其远端VxP基团而泛素化,并促进蛋白酶体降解。BI-3802治疗可以形成含有BCL6和SIAH1的细胞内病灶。这些发现阐明了一种新的靶向蛋白降解机制,即小分子通过特定药物诱导聚合和降解使靶蛋白失活,为治疗药物和合成生物学的发展提供了新的策略。

Bi Bcl6 泛素

推荐资讯