第一作者:Kui He
通讯作者:刘锦斌
通讯单位:华南理工大学
近日,华南理工大学刘锦斌教授等人在Nano Research发表了题为" In situ self-assembly of near-infrared-emitting gold nanoparticles into body-clearable 1D nanostructures with rapid lysosome escape and fast cellular excretion"的研究论文,报道了用原位合成策略制备了一种具有强近红外发光,快速溶酶体逃逸和有效体内清除的一维AuNPs组装材料(AuNPs@CP)。
研究背景
超小发光金纳米粒子(AuNPs, d < 3 nm)具有独特的光学性质、良好的生物相容性和可被肾脏清除的优势,已成为一类备受关注的新型荧光纳米成像探针。该类新型的光学探针经过功能化修饰或自组装的发光AuNPs均可以作为一种基因或药物的载体,如用阳离子聚合物通过静电组装的方式将单分散的AuNPs进行自组装以增强其发光量子效率并改善其载药传递能力。
然而,发光AuNPs组装体结构在基因或药物的传递或转运过程中起到至关重要的作用。通常组装体在细胞内化过程中易停留在溶酶体内而降低其传递效率,且含有难降解及动物体内清除能力低的纳米结构还会引起生物安全性问题,将不利于AuNPs的临床医学转化。因此,如何制备具有强近红外发射,快速溶酶体逃逸和细胞排出及可体内清除的发光AuNPs组装体在疾病诊疗方面具有重要的意义。
成果简介
近日,华南理工大学刘锦斌教授等人报道了用原位合成策略制备了一种具有强近红外发光,快速溶酶体逃逸和有效体内清除的一维AuNPs组装材料(AuNPs@CP)。
文章通过设计一种环状多肽(cyclo-(ARARARAD)-Acp-C),含三个精氨酸(R),四个丙氨酸(A)和一个与6-氨基己酸(Acp)末端相连的半胱氨酸(C),该环状多肽在一定pH条件下可通过环肽分子骨架上的 C=O 和 N–H 形成分子间的氢键网络,然后再通过β-片层反平行方式堆积形成长度可调的中空一维纤维状结构。
作者利用这种长度可调的自组装多肽为模板分子,同时以谷胱甘肽(GSH)为表面配体通过原位合成的方法来制备具有结构可控的一维近红外发光AuNPs组装体,环肽支链末端的半胱氨酸提供巯基可用于AuNPs的原位合成与组装并增加其发光性能,而三个精氨酸的设计可以使纳米组装材料更好的与细胞膜或质粒DNA 结合以增强其负载功能和实现其快速溶酶体逃逸。
要点1:一维近红外发光AuNPs组装结构制备与表征
作者通过原位合成策略所制备的一维近红外发光AuNPs组装结构示意图如图1所示,由图可知AuNPs@CP具有近红外发光特点(810 nm)且其发光量子效率与之前所报道的AuNPs相比提高近6倍。图1(d)表明,所合成的AuNPs@CP中AuNPs的尺寸为1.8 ± 0.3 nm,且纳米纤维组装材料的平均长度约为600 nm。由AFM表征得到AuNPs@CP及多肽自组装模板分子的高度差统计为 ~ 1.1 nm,进一步表明AuNPs很好的分布在组装环状多肽模板分子上。
图1. AuNPs@CP的表征结果图。(a)AuNPs@CP的合成示意图;(b)AuNPs@CP的荧光光谱图;(c)AuNPs@CP的TEM、SEM及AFM的表征结果图;(d)AuNPs@CP长度及AuNPs的尺寸统计分析;(e)AFM表征AuNPs@CP及多肽自组装模板的高度统计分析。
要点2:细胞成像及共定位分析
作者通过对细胞溶酶体标记,对AuNPs@CP及GSH为单独配体的AuNPs(GS-AuNPs)进出细胞的路径进行了探究,如图2所示,从共定位统计的结果发现,AuNPs@CP由于环状多肽上精氨酸的作用,可以使组装纳米材料快速地实现溶酶体逃逸,而单个GS-AuNPs与细胞作用12 h 后共定位系数约为0.64,表明单个的GS-AuNPs仍大部分停留在溶酶体内。文章还研究了不同抑制剂对细胞内吞的影响,进一步探讨了AuNPs@CP进入细胞的方式。
图2.(a,b)AuNPs@CP孵育HeLa细胞后AuNPs@CP(a)及GS-AuNPs(b)与GFP标记的溶酶体的共定位成像分析;(c)AuNPs@CP(左)及GS-AuNPs(右)与GFP标记的溶酶体共定位统计分析;(d,e)HeLa细胞对AuNPs@CP和GS-AuNPs的内吞量(d)及排出量(e)随时间的变化图。
要点3:基因转染及过表达细胞株的构建
为了探讨这种近红外发光一维组装材料作为基因传递载体在基因转染方面的效率,作者对不同的载体负载质粒pcDNA3.1(+)-IRES-GFP-p53转染HeLa细胞进行了研究。如图3(c)所示,AuNPs@CP 具有良好的转染效果,其转染效率将近60.4%且无明显毒性。在3(e)中,Western blotting结果可知由AuNPs@CP负载质粒pDNA转染HeLa细胞后,其p53蛋白表达量为野生型HeLa 细胞p53蛋白表达的7.5倍。这些结果进一步证明近红外发光的AuNPs@CP作为基因传递载体具有很好的传递效率。
图3.(a)AuNPs@CP负载质粒DNA用于细胞转染的示意图;(b)负载质粒DNA转染HeLa细胞后的共聚焦荧光成像图;(c)负载质粒pcDNA3.1(+)-IRES-GFP-p53 (pDNA)转染HeLa细胞的转染效率统计结果分析;(d)AuNPs@CP与GS-AuNPs的细胞毒性结果;(e)PEI对照实验的细胞毒性分析;(f)Western blotting 分析负载质粒pDNA转染HeLa细胞后p53蛋白的表达情况。
要点4:体内转染及代谢分析
最后,作者还考察近红外发光的AuNPs@CP在活体内的基因转染效率以及其在体内的代谢方式及生物安全性,从图4(d)可知,通过瘤内注射AuNPs@CP-pDNA 72小时后,尿液和粪便中检测到金的含量分别为 (35.2 ± 2.6) % ID 和(15.3 ± 7.6) % ID,而主要的器官(如:心、肝、脾、肺、肾)中残余量均低于5% ID/g,表明瘤内注射的AuNPs@CP-pDNA可以通过肾和肝的方式排出体外。从免疫荧光成像(4(e))及其定量分析图(4(f))可知,瘤内注射AuNPs@CP-pDNA后肿瘤部位p53蛋白表达明显增加,约为对照组生理盐水的1.9倍,表明近红外发光的AuNPs@CP作为基因传递载体在体内具有良好的转染功能。而结合不同组织器官的病理分析表明AuNPs@CP基本无可观察到的生物毒性。该研究表明这种以多肽自组装为模板分子原位合成的一维金属纳米结构,有望用于未来的癌症诊断及可视化治疗。
图4.(a)瘤内注射AuNPs@CP-pDNA及其代谢路径示意图;(b)瘤内注射AuNPs@CP-pDNA后小鼠体内成像图;(c)瘤内荧光随时间变化统计图;(d)瘤内注射AuNPs@CP-pDNA 72小时后体内的分布情况;(e,f)瘤内注射AuNPs@CP-pDNA后肿瘤部位p53蛋白检测的免疫荧光成像图(e)及对过表达p53蛋白的定量统计分析(f)。
参考文献
He, K., Zhu, J., Gong, L. et al. In situ self-assembly of near-infrared-emitting gold nanoparticles into body-clearable 1D nanostructures with rapid lysosome escape and fast cellular excretion. Nano Res. (2020).
https://doi.org/10.1007/s12274-020-3153-6
作者简介
刘锦斌教授课题组简介:刘锦斌,男,教授/博导。长期从事发光金属纳米探针及其生物医学成像的研究工作。获得过国家及省市多项科研项目(人才计划)的资助,课题组具有良好的科研环境和平台支持。近年来,在J. Am. Chem. Soc.、Angew. Chem. Int. Ed.、ACS Nano、Adv. Funct. Mater.、Small和Anal. Chem.等国际高水平期刊上发表SCI论文60余篇。
识别二维码或点击左下角“阅读原文”
可访问全文
Nano Research公众号
微信号:Nano_Research
网址:www.thenanoresearch.com