2020 年11 月27 日,Science Advances在线发表了来自北京大学钟上威团队题为Touch-induced seedling morphological changes are determined by ethylene-regulated pectin degradation的研究论文。该研究揭示了编码聚半乳糖醛酸酶的PGX3介导果胶基质中触碰施加的改变和形态发生的机制。研究也发现触碰激活乙烯信号通路,转录因子EIN3可以直接结合PGX3的启动子,这种结合对于触碰抑制PGX3表达是必需的。本论文通过 EIN3-PGX3将机械触碰与细胞壁重塑建立了联系,并证明触碰调节的细胞壁重塑是瞬时的和可逆的,从而确保埋藏的幼苗在生长和从土壤中出来时的适应性。
为了研究幼苗从土壤中萌发的机械响应,作者设计了一种触碰试验,黑暗中将幼苗分别置于深板或浅板的1/2 MS培养基中生长3天。在深板中,黄化的幼苗向上生长而没有触碰到盖子。在浅板中,种子发芽2天后,黄化的幼苗接触碰到盖子,并在来自平板盖子的机械阻力下再生长一天。对幼苗下胚轴长度和刚度的检测表明,来自盖子的机械触碰抑制了下胚轴细胞的伸长,并提高了细胞壁的硬度。进一步的研究显示,机械触碰显著降低了黄化幼苗的总寡半乳糖苷酶(PG)活性,表明触碰诱导下胚轴细胞伸长抑制和细胞壁变硬与抑制PG介导的果胶降解有关。
为了探讨触碰抑制细胞壁果胶降解的分子机制,作者分析了PG基因响应机械触碰的表达水平。在浅板中生长的野生型(WT)幼苗中,触摸显著抑制了PGX3的表达量,但不影响PGX1和PGX2。作者也构建了PGX3自身启动子驱动的转基因株系 PGX3p-PGX3-Myc/pgx3。Western Blot的结果显示,在深板中生长的PGX3pc / pgx3幼苗中PGX3蛋白积累的水平比浅板中生长的幼苗高。但是,在深板中生长组成型表达的35S-PGX3-Myc / WT转基因植物中PGX3-Myc的蛋白质水平没有改变,表明触碰不调节PGX3的蛋白质稳定性。由于PGX3是功能性PG,因此作者检测了PGX3是否介导了触碰抑制PG的活性。与WT幼苗相比,pgx3幼苗在深板中下表现出组成型降低的PG活性,而PGX3pc / pgx3完全恢复了pgx3幼苗中降低的PG活性。说明,PGX3介导的PG活性在调节黄化幼苗的形态发生反应中起主要作用。为了进一步解析PGX3介导的触碰响应的特征,作者进行了PGX3表达量的短期分析。qPCR结果表明,触碰处理可有效抑制PGX3的表达,并在处理0.5小时后达到稳定水平。那么是否这种瞬时触碰处理引起了幼苗的形态发生变化?在浅板中,触碰处理1或2小时不会显着影响下胚轴长度。但是在触碰处理超过4小时后,下胚轴长度开始减少,并且随着触摸处理时间的延长,下胚轴长度的减少变得更加明显。一个有趣的现象,PGX3 在mRNA或蛋白水平的快速响应与持续触碰以实现下胚轴生长抑制的需求之间的差异意味着触碰对PGX3的抑制作用可能是可逆的。为了验证这一假设,作者将生长2天的黄化幼苗暴露于短期的触碰处理中1小时,然后移开盖让幼苗继续保持原状生长。检测结果表明,触碰抑制的PGX3表达在停止触碰处理后1小时内部分恢复,并在4小时内完全恢复其原始水平。所以,触碰快速可逆地抑制了黄化幼苗中PGX3的功能。接下来作者探索了幼苗的机械触碰与PGX3介导的形态调控之间的分子联系。之前的研究表明,乙烯可以促进幼苗出土(1, 2, 3)。通过盖触碰试验,我们发现在浅板中生长的幼苗比深板中生长的幼苗释放更多的乙烯气体,并且乙烯以剂量依赖性方式抑制在深板中生长的幼苗的下胚轴伸长,这些结果表明乙烯与幼苗对机械触碰的响应有关。EIN3是乙烯信号传导途径中的主要转录因子。作者的数据表明,机械触碰显著提高了深板中幼苗的EIN3蛋白水平。用碘化丙锭(PI)染色观察下胚轴细胞发现,用乙烯前体ACC处理可明显降低野生苗的细胞长度,而EIN3(EIN3ox)的过表达导致下胚轴细胞的组成型缩短。随后作者检测了EIN3及其同源蛋白EIL1的双突变体ein3eil1的表型,在浅板中生长的ein3eil1大部分缺失机械触碰介导的下胚轴伸长抑制,表明触碰抑制的下胚轴细胞伸长需要EIN3。为了剖析乙烯对PGX3的调节作用,作者实时监测了PGX3基因表达响应乙烯的动态变化,表明乙烯主要在转录水平上抑制黄化幼苗中PGX3的蛋白丰度。Fig. 4乙烯通过抑制转录降低黄化幼苗中PGX3的蛋白丰度。作者进一步探讨了乙烯是否通过EIN3抑制PGX3。在烟草中共表达EIN3和PGX3显著降低了PGX3介导的LUC活性。在β-雌二醇诱导EIN3的实验中,作者得到了相同的结论。那么EIN3是同时什么方式抑制PGX3的表达呢?作者分析了PGX3的启动子序列,并鉴定出四个已知的保守EIN3结合位点(EBS)基序,推测EIN3可能直接结合PGX3的启动子。后续的Y1H和EMSA数据表明,EIN3可以通过EBS基序接结合PGX3的启动子。遗传实验也分析了EIN3和PGX3的上下游关系, pgx3ein3eil1三突变体展现出类似pgx3的表型,表明EIN3作用在PGX3的上游。Fig. 5 PGX3在EIN3的下游发挥作用,以调节黄化幼苗的形态和出土。北京大学生命科学院钟上威研究员为该论文通讯作者,吴青青博士为第一作者。该研究工作得到了国家重点研发计划青年专项,国家自然科学基金,以及蛋白质与植物基因研究国家重点实验室的资助。1. X. Shen, Y. Li, Y. Pan, S. Zhong, Activation of HLS1 by mechanical stress via ethylene-stabilized EIN3 is crucial for seedling soil emergence. Front. Plant Sci. 7, 1571 (2016).
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