文献详解|这篇ceRNA机制促进鼻咽癌转移和耐药的高分文章，依旧是我们熟悉的ceRNA研究“配方”

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今天给大家分享一篇ceRNA机制研究的文章，该文章从多层面多角度进行ceRNA调控关系构建和机制验证，包括生信预测筛选+体外细胞实验+体内动物模型实验+临床相关性+预后模型构建，方法齐全，思路严谨，当之无愧的ceRNA高分范文。

文章题目：Circular RNA CRIM1 functions as a ceRNA to promote nasopharyngeal carcinoma metastasis and docetaxel chemoresistance through upregulating FOXQ1

研究背景

（1） CircRNA可以充当竞争性内源性RNA（ceRNA）或编码蛋白质的RNA，或与RNA结合蛋白相互作用以调节参与肿瘤发生和发展的基因的表达，目前在鼻咽癌（NPC）中尚需阐明circRNA的功能和机制；

（2）放疗联合化疗是局部晚期鼻咽癌（NPC）的主要治疗策略，然而，远处转移和耐药仍然是治疗失败的主要原因，目前推荐的肿瘤转移（TNM）分期系统还不足以预测NPC患者是否是理想的化疗候选者，迫切需要探索新的生物标记物来确定治疗方法；

（3）由于circRNA的组织特异性表达和稳定性等生物学特点，它们有可能成为癌症的诊断、预后或治疗靶标的生物标志物。

研究思路

研究结果

鼻咽癌（NPC）转移相关CircRNA的筛选与验证

1）RNA-seq筛选目标circRNA：为了研究NPC中与转移相关的circRNA，作者用具有高转移潜能的S18细胞系和具有低转移能力的S26细胞系进行了RNA测序，差异表达分析筛选出了在高度转移的S18细胞系中差异上调最高的circRNA--Hsa_circ_0002346（chr2：36623756–36,669,878）。通过定位人类参考基因组（GRCh37 / hg19）发现hsa_circ_0002346源自CRIM1基因的外显子，因此作者将其命名为“ circCRIM1”。

2）目标circRNA表达量验证：设计了跨越circCRIM1的反向剪接连接的特异性引物，通过qRT-PCR检测circCRIM1在NPC细胞系和临床组织中的表达。结果一致表明circCRIM1在具有远处转移的NPC患者中特别上调。

3）环状结构验证：扩增后的PCR产物进行Sanger测序，进一步证实了circCRIM1的反向剪接位点。核糖核酸酶（RNase R）处理上述的PCR扩增产物，结果表明circCRIM1对RNase R具有抗性，进一步证明了circCRIM1的环状结构（答疑时刻：circRNA的结构因为缺少5’帽子和3’尾巴，所以对核糖核酸酶的消化具有抗性）。使用来自鼻咽癌细胞的cDNA和基因组DNA（gDNA）扩增CRIM1 mRNA和circCRIM1，结果仅在cDNA中检测到circCRIM1，而在gDNA中检测不到。

体外实验验证CircCRIM1对鼻咽癌细胞表型的影响

1） CircCRIM1促进鼻咽癌细胞迁移、侵袭：设计了两个短干扰RNA（siRNA）专门靶向circCRIM1的反向剪接位点，但不改变线性CRIM1 mRNA的表达，还构建了circCRIM1过表达载体，以转染低转移NPC细胞系S26。CircCRIM1在S26细胞中成功地过表达，而CRIM1 mRNA没有明显变化。Transwell分析表明，敲除circCRIM1表达可显着抑制高转移细胞系的迁移和侵袭能力。挽救实验表明，异位表达circCRIM1-si-mut可以完全挽救内源性circCRIM1敲低后的抑制作用，并促进NPC细胞迁移和侵袭。同时，异位circCRIM1表达显着促进S26细胞迁移和侵袭。综上，circCRIM1在体外可促进NPC细胞的迁移和侵袭能力。

2） CircCRIM1促进鼻咽癌上皮间充质转化（EMT）：作者发现当在高转移细胞系S18和HONE1细胞中敲除circCRIM1表达时，NPC细胞形态从纺锤形或细长的间充质变为上皮形式，这表明circCRIM1可能在诱导NPC细胞EMT。因此，作者进行了免疫荧光染色和蛋白质印迹实验，以检验circCRIM1对上皮和间充质标记表达的影响。结果表明，circCRIM1下调显着增加了NPC细胞的上皮标志物（E-cadherin）表达，但降低了间充质标志物（N-cadherin和Vimentin）表达。综上，circCRIM1在体外可促进NPC上皮间充质转化。

CircCRIM1作为ceRNA海绵的机制研究

1）CircCRIM1亚细胞定位：作者对核和细胞质circCRIM1 RNA进行了qRT-PCR和FISH分析，发现circCRIM1转录本主要位于细胞质中（有研究表明在细胞质中稳定和高表达的circRNA是理想的ceRNA）。鉴于circCRIM1富含于细胞质，作者进一步探讨了circCRIM1是否在鼻咽癌的致病过程中充当ceRNA。RNA免疫沉淀（RIP）分析表明，AGO2抗体显着丰富了circCRIM1，表明circCRIM1可能具有miRNA相关功能（答疑时刻：AGO2蛋白参与miRNA的装配和功能行使，所以可以通过该蛋白钓出miRNA）。

2）预测circCRIM1相互作用的潜在miRNA：

①　通过微阵列分析S18和S26 NPC细胞的miRNA表达谱基因表达差异分析，筛选出在高转移S18细胞系中98个下调的miRNA。

②　对下调的miRNA进行miRanda，RNAhybrid和StarBase 的生物信息学算法预测，发现miR-422a和miR-4436a包含circCRIM1区域的推定靶向位点。

③　作者进行了荧光素酶测定及双重FISH分析，结果表明circCRIM1和miR-422a在NPC细胞中共定位，circCRIM1可以直接结合miR-422a。

3）预测miR-422a和circCRIM1的下游靶标：作者采用了miRDB算法预测到FOXQ1是circCRIM1和miR-422a的假定靶基因。为了证实这一结论，作者构建了一个荧光素酶报告载体，该载体具有miR-422a的野生型或突变的FOXQ1 3'UTR结合位点。在用miR-422a模拟物转染的NPC细胞中，FOXQ1 3'UTR野生型报告基因的荧光素酶活性显着降低。然而，当与突变的FOXQ1 3'UTR报告基因共转染时，对于混乱的对照和miR-422a模拟物，荧光素酶活性没有显着差异。qRT-PCR和蛋白质印迹分析表明，miR-422a过表达显着降低了FOXQ1 mRNA和蛋白水平。同样，circCRIM1耗竭显着抑制FOXQ1表达。相反，circCRIM1过表达显着增加了FOXQ1表达。这些数据表明FOXQ1可以由miR-422a和circCRIM1调控。

4）评估FOXQ1对NPC表型的影响：作者使用已发布的NPC数据集（GSE12452）进行了GSEA分析，以比较具有高和低FOXQ1表达的NPC样品的基因谱。结果表明高FOXQ1的NPC富含与转移相关的基因集，这与circCRIM1在NPC转移中的促进作用相一致。此外，在高FOXQ1表达的NPC患者中，化学抗药性（Patterson_Docetaxel_Resistance）丰富。接下来，作者研究了circCRIM1是否调节对多西他赛的化学敏感性。CCK8和集落形成实验表明，circCRIM1耗竭显著增强了NPC细胞对多西他赛的敏感性（答疑时刻：CCK-8试剂中含有WST-8，它在电子载体1-Methoxy PMS的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan dye）。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析）。总的来说，FOXQ1可能发挥类似于circCRIM1的功能来促进NPC细胞转移和多西他赛化学耐药性。

5）确定ceRNA调控机制--CircCRIM1通过减弱miR-422a对FOXQ1的抑制作用来促进NPC细胞转移和EMT：为了确认circCRIM1是否通过miR-422a发挥其促进作用，在miR-422a抑制剂转染以降低其表达后进行了Transwell测定。结果发现miR-422a敲低可以显着恢复circCRIM1下调对NPC细胞迁移和侵袭能力的抑制作用。此外，上皮标记物（E-cadherin）表达受损和间充质标记物（Vimentin）表达增加证明miR-422a抑制作用显着消除了circCRIM1下调诱导的FOXQ1表达和EMT抑制作用。因此，这些发现表明circCRIM1调节FOXQ1表达并促进NPC细胞通过miR422a迁移和侵袭。

接下来，作者研究了circCRIM1-miR-422a对NPC细胞的促进作用是否需要FOXQ1。实验发现FOXQ1的耗竭基本上挽救了由circCRIM1过表达引起的增强的NPC细胞迁移和侵袭。此外，FOXQ1的抑制作用显着逆转了外源性circCRIM1操纵在NPC细胞中诱导的FOXQ1表达和EMT的增加。综上所述，这些结果表明，circCRIM1作为miR-422a的海绵体，通过ceRNA机制调节FOXQ1表达并促进NPC细胞转移和EMT。

体内实验验证CircCRIM1促进NPC细胞转移和耐药

为了评估circCRIM1对体内NPC转移的影响，作者构建了腹股沟淋巴结转移小鼠模型和肺转移定植小鼠模型。H＆E染色证实，circCRIM1耗竭的小鼠表现出侵袭性较小的表型。值得注意的是，在体内circCRIM1-nockdown组的肺转移性结节中发现了一致低水平的circCRIM1和FOXQ1表达，说明与circCRIM1敲低的抑制作用一致，FOXQ1下调显着减少了小鼠的肺转移性肿瘤。

此外，作者评估了circCRIM1对多西他赛治疗的影响。结果显示circCRIM1的下调显著增强了多西他赛治疗NPC细胞转移的功效。总之，这些发现表明，circCRIM1通过在体内调节FOXQ1促进NPC细胞转移和多西他赛化学耐药性。

评估circCRIM1在NPC中的临床价值

1）circCRIM1与NPC患者临床病理相关性分析：作者通过qRT-PCR确定218位NPC患者组织中circCRIM1的表达。根据ROC分析，有58％患者的circCRIM1表达低，而42％患者的circCRIM1表达高。而且相关性分析表明，circCRIM1表达水平与N期，死亡和远处转移显着相关。Kaplan–Meier生存分析表明，circCRIM1表达高的患者的总生存期（OS），无病生存期（DFS）和远处无转移生存期（DMFS）减少。此外，多因素Cox回归分析发现circCRIM1表达是NPC的独立预后指标。综上分析表明，circCRIM1是NPC生存的独立因素，从而证实了circRNA在NPC中的预后重要性。

2）构建基于circCRIM1表达和N期的NPC预后预测模型：

①　预后模型构建：作者基于circCRIM1表达水平和N期建立了预后预测模型，将患者分为3组：低风险组（低circCRIM1表达和早期N期）；中风险组（高circCRIM1表达或晚期N期）；高危组（circCRIM1高表达和晚期N期）。这三组患者的死亡，复发和远处转移的风险显着不同。

②　预后模型评估：作者使用基于circCRIM1的预后模型评估了circCRIM1表达对含多西他赛的治疗敏感性的预测值表达状态和N阶段。在低风险组中，接受多西他赛治疗的患者远距离转移控制明显优于未接受多西他赛治疗的患者。相反，中度或高危患者没有从含多西他赛的治疗中受益。这些发现表明，circCRIM1表达与N期的结合可以成为区分具有不同转移风险和对基于多西他赛治疗反应患者的标志。综上所述，我们的研究表明，circCRIM1通过海绵化miR-422a发挥其ceRNA的功能，以调节下游FOXQ1的表达，因此促进了NPC的转移和基于多西他赛的IC化学耐药性。

总结

（1）通过生信分析筛选到在NPC转移患者中显著上调的circRNA（circCRIM1）；

（2）体外细胞实验及体内动物模型实验证实circCRIM1通过ceRNA机制，与miR-422a竞争性结合，从而减轻miR-422a对FOXQ1的抑制作用，进而促进NPC细胞转移和多西他赛化学耐药性；

（3）构建了基于circCRIM1表达和N期的预后模型，可以对NPC患者的多西他赛治疗获益和转移风险进行预后预测，具有重要的临床价值。

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