科研 | Ecology：氮添加导致土壤细菌多样性和组成发生改变的关键阈值

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编译：厚朴，编辑：小菌菌、江舜尧。

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导读

土壤细菌群落是调节陆地生物地球化学循环和生态系统功能方面的关键。全球氮沉降的增加已经对陆地生态系统的很多方面产生了影响，但本研究对输入的氮水平是否有一个阈值仍只有初步的了解，超过这个阈值土壤细菌群落将经历关键的转变。利用16s rRNA基因的高通量测序，研究了中国北方温带草原土壤细菌对长期（13年）施氮（多水平）的响应。

本研究的结果表明，随着施氮量的增加，植物多样性呈线性下降。然而，细菌多样性对添加的氮响应是非线性的，当添加的氮水平低于16 g N m^-2 yr^-1 时不受影响，但是当添加的氮水平超过32 g N m^-2yr^-1 时显著降低。对同一研究区域内四个氮添加实验的meta分析进一步证实了细菌多样性对输入的氮的非线性响应。土壤细菌群落结构的潜在变化也发生在氮添加水平为16 g N m^-2 yr^-1 到32 g N m^-2yr^-1之间。进一步分析表明，土壤细菌多样性的丧失主要归因于土壤pH值的降低，而土壤细菌群落的变化是由土壤N有效性的增加、土壤pH值的降低和植物群落结构的变化共同驱动的。此外，本研究发现氮的添加使细菌群落向更可能的富营养类群转移。总而言之，本研究确定了细菌多样性和群落组成的关键阈值。在本研究中观察到的细菌多样性对输入的氮的非线性响应表明，尽管细菌群落对低水平的氮输入有抵抗力，但输入的氮的进一步增加可能触发一个临界转变，使细菌群落进入低多样性状态。

论文ID

原名：Critical transition of soil bacterial diversity and composition triggered by nitrogen enrichment

译名：氮添加驱动土壤细菌多样性和组成发生临界转变

期刊：Ecology

IF：4.285

时间：2020.4

通讯作者：刘玲莉

通讯作者单位：中国科学院植物研究所

实验设计

实验地点位于中国北方内蒙古多伦县半干旱草原(42.01´ N, 116.16´E and 1324 m a.s.l)。年平均温度和降雨量分别是2.1 °C 和 382.3毫米。土壤类型为单质钙质土（FAO分类），含69.21 ± 0.06%（标准误差）的砂、15.60 ± 0.02%的粉土和15.19 ± 0.02%的粘土。土壤pH值约为6.84 ± 0.02。在本研究的实验地点，植物群落主要由克氏针茅、冰草、冷蒿和方叶闭杆菌组成。土壤pH值约为6.84 ± 0.02。在本研究的实验地点，植物群落主要由克氏针茅、冰草、冷蒿和糙隐子草组成。

64个10×15 m的样方，相邻样方之间有5 m的缓冲带，排列成8行8列。从2003年开始，每行8个样方随机分配到8个施氮水平（0、1、2、4、8、16、32和64 g m^-2yr^-1）中的一个。在草地生态系统中，施氮水平与其他施氮试验相当。每年7月以尿素的形式施氮。自2005年以来，每年8月底剪四排（每两排剪一排）。2016年8月15日，从所有非刈割样方采集土壤样本。在每个样地中随机取6个土芯（深15 cm，直径5 cm），并组成一个混合样品。通过2 mm筛网后，将土壤样本储存在冰上并转移到实验室。样品分别储存在4 °C和-80 °C分别用于土壤理化分析用于DNA提取。

2016年8月15-18日，通过收割活生物量估算植物物种丰富度和地上植物生物量。本研究使用随机选择的1×1m样方在每个小区中计算植物物种数。所有活的植物组织都是从每个样方中的1×1 m样方框中采集的。所有植物样品在70℃下烘干48小时，并称重以测定每种植物的生物量。

对所有的数据进行正态性检验（Shapiro-Wilk检验），有必要时会对数据进行对数转换。对细菌和植物的alpha多样性进行方差齐性检验（The Levene's检验）。单因素方差分析评估氮添加对土壤细菌和植物多样性的影响。对不同的处理之间进行多重比较（Tukey HSD检验）。Spearman相关关系用来检验每个细菌类群（门水平）的相对丰度和氮添加水平之间的关系。

为了检验氮添加如何影响细菌群落组成，使用R中的“vegan”软件包，通过基于Bray-Curtis差异矩阵的非度量多维标度（NMDS）排序来可视化细菌群落结构。利用R包“vegan”中的adonis函数，采用置换多元方差分析（PERMANOVA）研究了施氮对土壤细菌群落结构的影响。利用Bray-Curtis差异的两两比较，评价了不同施氮水平下土壤细菌群落结构的差异。此外，本研究还进行了置换多元群分散均匀性（PERMDISP2）试验，以测试添加N对细菌群落分散均匀性的影响。

本研究进一步评估了细菌群落对不同水平的氮的响应。本研究使用R包TITAN2进行阈值指标分类分析（TITAN）进一步评估了细菌群落对不同水平氮的输入的响应。TITAN是用来检测分类组成沿着环境梯度的变化，并评估分类群变化点之间的同步性，作为群落阈值的证据。简而言之，每个分类单元都被分配到一个指标值（IndVal）分数，该分数考虑了发生频率、比例丰度和分类单元变化的方向。计算所有物种在N输入梯度的所有可能变化点的IndVal分数，并通过排列试验评估这些分数的不确定性。指标z得分是通过标准化原始IndVal得分，使用N水平排列样本的平均值和标准差来计算的。z值区分了对N添加的负（z-）和正（z+）分类群响应。导致最大[和（z-）]的N水平值代表了群落水平阈值，在该阈值附近，细菌类群的发生频率和丰度具有最大的聚集负变化。

利用rrnDB数据库，根据每个OTU的rRNA操作子拷贝的最接近亲属，搜索并估计每个OTU的rRNA操作子拷贝数。然后，本研究计算每个土壤样本的丰度加权平均rRNA操作拷贝数。为此，本研究计算了估计的操作拷贝数和每个OTU的相对丰度的乘积，并对每个样本的所有OTU的这些值求和。采用线性回归分析方法，检验丰度加权平均rRNA操作数与施氮水平的关系。

采用结构方程模型（SEM）研究了施氮对土壤细菌丰富度的影响途径。基于本研究对关于氮富集对细菌丰富度影响的认识，本研究建立了一个先验模型，允许对土壤化学性质、植物生产力、植物丰富度和细菌丰富度之间的联系进行假设的因果解释。以土壤全氮浓度和溶解态无机氮浓度作为潜在变量来表征土壤氮素有效性。在进行结构方程模型之前，氮添加水平进行自然对数的转换。使用AMOS软件进行结构方程模型的分析。本研究使用均方根近似误差（RMSEA）和比较拟合指数（CFI）来评估模型拟合。

通径分析也可用于探索相关因素之间的因果关系。本研究采用Mantel通径分析法定量分析了土壤化学性质和植物群落组成对细菌群落组成的直接和间接影响。部分Mantel检验是通过保持所有其他变量不变来估计两个变量之间的路径系数。对细菌群落和植物群落分别采用Bray-Curtis非相似性矩阵。将土壤化学变量（全N、DIN和pH）进行Hellinger变换，并根据这些变量的欧氏非相似性计算出样本间的距离。使用R软件中的ecodist软件包进行部分Mantel检验。

为了探究在内蒙古草地氮输入和细菌多样性之间是否存在非线性的响应，本研究使用Web of Science通过搜索氮添加研究进行了meta分析。使用以下规则筛选文献：1）在内蒙古高原上进行氮添加实验；2）至少有3个氮添加水平梯度；3）16 S rRNA基因序列的原始数据可以从NCBI或者作者那获得。本研究总共获得了4个实验研究进行meta分析。

本研究遵循与本研究自己的实验相同的工作流程，使用QIIME v.1.8.0处理来自这四项研究的测序数据。基于97%的序列一致性将OTU分配给Greengenes参考数据库中的序列，并对所有样本在相同深度的序列数进行归一化后计算OTU丰富度。本研究通过将实验组的平均值除以对照组的平均值来计算不同施氮率下OTU丰富度的响应比，从而便于本研究在四个研究中进行比较。响应比作为meta分析的效应大小。

本研究收集了内蒙古草原其它4个氮添加试验的OTU丰富度响应比数据，并用平滑的曲线来确定N水平的可能阈值。本研究首先使用R包“freenotsplines”中的函数“fit.search.numknots”进行节点的选取。基于AICc值选择最佳节点数和曲线。然后，在R包freenotsplines中使用freelsgen来确定结点的位置，freenotsplines可以解释为细菌α多样性响应比急剧变化的N水平的阈值。所有统计分析均采用版本R 3.5.2。P<0.05具有统计学意义。

结果

1 土壤细菌和植物群落对添加的氮的响应

土壤细菌序列总共聚类成2740个基本分类单元。细菌多样性，具体包括OTU丰富度，Chao1, Shannon多样性和Simpson’s 多样性指数，随着氮添加水平增加多样性指数降低。在对照处理和氮添加水平低于16 g N m^-2 yr^-1时的处理中细菌多样性没有显著差异，但是在最高的两个氮添加水平（32和64 g N m^-2 yr^-1）下显著下降。与细菌不同的是，植物多样性、Shannon多样性指数、Simpson’s多样性指数随着氮添加水平线性降低（图1）。

图1 氮添加对土壤细菌和植物多样性的影响。细菌OTU丰富度和植物丰富度（a），细菌Chao 1多样性指数（b）,细菌和植物Shannon-wiener 多样性指数（c）,细菌和植物Simpson 多样性指数（d）。所有的数据以均值±标准误（n=4）的形式呈现。不同的字母代表氮添加处理之间有显著的不同。

Proteobacteria细菌门中占优势的是Alphaproteobacteria，但是不受氮添加的影响（图2）。Bacteroidetes, Saccharibacteria, Betaproteobacteria 和 Gammaproteobacteria的相对丰度随着氮添加而增加，然而Acidobacteria, Actinobacteria, Chloroflexi, Nitrospirae,和Deltaproteobacteria随着氮添加而降低。

图2 主要细菌分类单元相对丰度随不同的氮添加水平的变化。在每个氮添加水平下仅展示了平均相对丰度 >1%的细菌分类单元。所有的数据以均值±标准误（n=4）的形式呈现。右边的数字代表氮添加水平和细菌相对丰度的相关系数（Spearman’s p 值）。

细菌群落组成和beta多样性都受添加的氮的显著影响（图3a）。接受氮添加水平为32和64 g N m^-2 yr^-1的样方里的细菌群落与接受氮添加水平低于16 g N m^-2 yr^-1的样方里的细菌群落不同。然而在两个最高的氮添加水平中细菌群落没有差异。TITAN结果分析表明细菌群落结构发生改变的转折点在16 g N m^-2 yr^-1和32 g N m^-2yr^-1中间（图3b）。

图3 增加氮输入下细菌群落结构的非计量多维标度分析（a）。细菌群落改变点（b）。

2 土壤细菌多样性和群落结构与环境变量和植物群落的联系

结构方程模型的结果表明氮的添加对细菌丰富度有负面影响，因为它导致土壤有效氮的增加，以及土壤pH的降低（图4）。Mantel通径分析（图5）的结果表明，在考虑了所有其他环境变量后，植物群落组成对土壤pH的响应最强烈。细菌群落组成不仅受土壤pH和无机氮的影响，还受植物群落组成的影响。

图4 结构方程模型分析氮添加通过土壤pH，土壤氮的有效性，植物丰富度和地上生物量对土壤细菌丰富的影响。土壤氮的有效性是一个潜变量，是由可溶性无机氮和全氮共同定义的。方框表示测量变量，椭圆表示潜变量。“↓”表示氮的添加使其显著减少。模型拟合的结果是λ² = 13.513, P = 0.095, d.f. = 8, CFI=0.971, RMSEA = 0.054, 和 n = 32。红色和蓝色的实箭头分别代表显著的正效应和负效应（P < 0.05）。没有显著效应的路径用虚线呈现（P > 0.05）。变量旁的数字代表模型所能解释的方差（R²）。箭头上的数字代表标准化的路径系数。

图5 将细菌群落的分类组成与土壤化学性质和植物群落联系起来的Mantel通径分析。靠近方框之间路径的值表示部分Mantel系数，类似于矩阵之间的回归权重，而不是单变量，并显示了关系的大小。实线和虚线分别表示显著路径和不显著路径，P<0.05。线宽与相关系数成正比，P值在括号中。

3 内蒙古草地氮添加对细菌多样性影响的meta分析

内蒙古4个草地土壤细菌OTU丰富度与氮素输入量的增加呈非线性关系（图6）。在收集所有四个研究地点的数据时，本研究发现，在氮输入达到大约28 g N m^-2 yr^-1的阈值后，细菌OTU丰度急剧下降（图6）。

图6 内蒙古4个草地土壤细菌OTU丰富度对施氮响应比与施氮水平的关系。

讨论

1 在温带草地土壤细菌多样性对氮添加的非线性响应

与本研究的假设一致，本研究发现在低氮水平的氮输入下细菌多样性不受影响，但是在16和32 g N m^-2 yr^-1下急剧降低。这一结果表明，细菌多样性对氮输入的响应是非线性的，而不是线性的，这也被本研究对内蒙古四个草地的meta分析所证实（图6）。与细菌多样性不同，随着施氮量的增加，植物多样性逐渐降低。与植物相比，细菌具有更大的生理可塑性、更高的种群密度和更大的传播能力。细菌的这些个体和种群特征可以部分解释为什么细菌群落对低水平氮输入的响应不如植物群落。事实上，内蒙古的另一项实验发现，与细菌群落相比，在较低的氮添加水平下，氮富集对植物群落的选择作用开始增强。

土壤pH控制实验发现，随着土壤酸化，细菌多样性降低，当土壤pH低于4.5时，细菌多样性下降幅度最大。此外，本研究的结构方程模型的结果也表明细菌多样性的降低与土壤pH值的降低密切相关，而pH值的降低是由氮输入量的增加引起的（图4）。Mantel通径分析表明，在氮添加下环境因素对土壤细菌群落的影响主要取决于土壤pH的变化。在本研究的研究中，当土壤pH值低于5时，两个最主要的细菌类群（Acidobacteria和Actinobacteria）的丰度急剧下降（图2）。一方面，优势细菌类群的丧失可能破坏了土壤细菌群落内的高阶相互作用，即形成复杂的种间相互作用网络。高阶相互作用的丧失可能导致许多其他分类群的进一步丧失，从而触发细菌群落向不同的、低多样性状态的转变。另一方面，营养物质的富集可能改变了微生物物种之间的相互作用，从互利共生到与营养物质供应增加的竞争也可能有助于形成低多样性的群落状态。值得注意的是氮输入从32 g N m^-2 yr^-1增加到64 g N m^-2yr^-1时没有导致细菌多样性的显著丢失，可能是因为氮输入的进一步增加没有引起土壤pH的显著改变。总而言之，范围较大的pH梯度（从6.8到4.6）与N输入的大范围相关，对于发现细菌多样性对N输入的非线性响应和N输入阈值的存在是必要的。

2 植物和细菌群落组成之间的联系

本研究的研究表明，N引起的环境因子和植物群落的变化都是细菌群落组成的原因。TITAN检验表明引起细菌群落结构变化的临界值出现在16 到32 g N m^-2yr^-1之间。本研究进一步分析还发现细菌群落的非相似性与植物群落的非相似性显著关联。这种联系的一个解释是，共同的环境因素有助于细菌和植物群落组成之间的关系，因为氮引起的土壤pH的变化同时影响细菌和植物群落的结构。然而，mantel路径分析表明，即使考虑到非生物环境变量的影响，细菌群落的组成与植物群落组成密切相关（图5），支持本研究的第二个假设，即氮富集下细菌群落组成的变化与植物群落组成的变化相关。植物群落组成对氮沉降条件下细菌群落组成变化的贡献表明，氮沉降条件下地上和地下多样性之间存在一些相关变异。这个结果可能反映了一个事实，植物为土壤细菌提供了微环境的同时也提供了有机质，所以当植物群落组成发生改变也会导致土壤细菌的生境和碳资源均发生改变，从而导致土壤细菌群落发生改变。为了更严格的区分植物群落和非生物的环境因子对土壤微生物群落的影响，有必要进行同时控制植物群落和非生物因子的实验。

3 沿着氮添加水平土壤细菌相对丰度的改变

长期氮的多梯度添加使土壤酸化程度也呈梯度变化，随着施氮量的增加，土壤pH值由6.8降至4.5。本研究预计， Bacteroidetes的相对丰度会随着N的增加而降低，由于其对pH低的不耐受。然而，Bacteroidetes相对丰度的响应与本研究的期望相反。类似地，本研究预计Nitrospirae，其在硝化的第二步进行亚硝酸盐氧化，的相对丰度在氮添加下会显著增加。然而，Nitrospirae的相对丰度显著降低，可能是由于增加的亚硝酸盐含量和降低的土壤pH。这些结果表明尽管土壤氮的供给和改变的土壤pH会改变细菌群落结构，但不能简单的用土壤化学的变化来预测特定细菌类群的变化。

根据寡营养-富营养的概念，富营养细菌在营养丰富的条件下通常具有较高的生长速率，而寡营养细菌具有较低的生长速率，但能够在营养不良的条件下保持生长。因此，增加氮的有效性应该有助于富营养细菌的生长，而不是寡营养细菌的生长。与之前的研究一致，本研究发现常与富营养的细菌相关的Gammaproteobacteria的丰度受添加的氮的刺激。与此同时，Acidobacteria和Nitrospirae的丰度，被定义为寡营养的细菌，随着氮输入的增加而降低。此外，本研究还发现，氮的添加促进了具有较高rRNA操作数的细菌的数量。rRNA操纵子拷贝数与细菌繁殖率和资源利用率相关，反映了细菌的生态策略，因为较高的rRNA操纵子拷贝数与生长较快的富营养细菌相关。在氮的添加下增加的丰度加权平均rRNA操纵子拷贝数，从而提供了另一种证据，表明增加的氮输入有利于富营养的细菌分类群。

此外，与寡营养细菌相比，富营养细菌更喜欢使用更不稳定的C底物，因此可能具有更高的C利用效率。然而，由于自然条件下的底物是不同性质的有机物的混合物，野外试验不能充分探讨细菌的生命策略、底物偏好与氮富集下C利用效率之间的关系。利用¹³C标记的葡萄糖和苯酚，本研究先前在同一试验点进行的实验室培养研究发现，氮的添加促进了土壤微生物对不稳定碳基质的碳利用效率，这与观察到的一些富营养细菌类群丰度的增加相一致（图2）。同时，施氮降低了土壤中难降解碳基质的微生物碳利用效率，这与研究点寡营养细菌类群的减少是一致的。野外观察到的细菌群落的变化和实验室培养观察到的C利用效率的变化都表明，N的富集使细菌群落向更多的富营养和远离更多的寡营养类群转变。值得注意的是富营养的细菌较寡营养的细菌更占优势这与其在更高资源投入下具有更强的竞争能力是一致的。特定的分类单元和总的群落组成的转变表明土壤细菌群落的周转是更广泛氮素富集的信号，而不是土壤pH的变化，主要影响细菌多样性。需要进一步的研究来评估其他生态系统中微生物多样性和群落组成对添加的氮的响应。

在温带草地中本研究发现了一个导致土壤细菌多样性和细菌群落组成急剧下降的关键临界值。此外，本研究的发现还表明细菌多样性的减少与氮输入引起的土壤pH降低有关，而与氮输入引起的植物多样性的降低无关。然而，在氮添加下土壤细菌群落组成的变化伴随着植物群落的变化，尽管植物多样性的变化是线性的而不是基于阈值的。此外，在本研究的实验地点，细菌群落组成转移到假定的富营养分类群，可能是对有效性氮的增加和不稳定的碳的供应的响应。本研究的发现向前迈进了一步，以了解氮沉降引起的生物和非生物驱动因素的变化如何相互作用，以调节细菌群落的转变。在未来氮沉降情景下，细菌群落的阈值响应对生态系统结构和功能的反馈作用有待进一步研究。

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