Nature重大突破！王二涛团队揭示豆科植物结瘤固氮的分子机制

来源：植物生物学

2020年12月10日，植生所王二涛团队在《Nature》发表了题为An SHR–SCR modulespecifies legume cortical cell fate to enable nodulation的研究论文。该研究报道了豆科植物蒺藜苜蓿皮层细胞中的SHORTROOT-SCARECROW（SHR-SCR）干细胞程序行使独特的生物学功能。SHR-SCR调控网络在整个豆类物种中都是保守的，响应根瘤菌信号有，并启动了豆类特异性皮质细胞分裂，从头进行了根瘤的器官发生和根瘤菌的适应。总之， SHR-SCR模块的获得能够使豆类的根瘤菌感染细胞分裂，这是根瘤菌内共生进化的关键。

豆科植物的皮层与非豆科植物的皮层在发育上是不同的：它可以响应植物激素或根瘤菌的共生信号而去分化，从而使结核的新生器官能够适应固氮根瘤菌（1，2，3，4）。然而，为什么共生固氮仅限于相对较少的植物物种，主要是豆科植物，仍不清楚。

为鉴定豆类中皮质细胞分裂反应的可能遗传因子，作者构建了蒺藜苜蓿和拟南芥基因的EGFP-β-葡萄糖醛酸苷酶报告分子EGFP-GUS。该报告分子由在非豆科植物中发挥重要作用的，并在蒺藜苜蓿毛状根中差异表达的那些基因的启动子来驱动。经筛选发现，拟南芥SCR（pAtSCR：EGFP-GUS）启动子驱动的报告基因表达仅限于蒺藜苜蓿毛状根和稳定转化的拟南芥中的静止中心和内胚层。

为确定皮质表达所需的MtSCR启动子中的调控元件，作者在拟南芥中构建了MtSCR启动子截短缺失的报告基因。鉴定到两个顺式调控元件：AT1-box（∆AT1）和enhancer（∆En），它们是结节共生所必需的。在其他豆科植物中同样表达SCR同源物，表明SCR非常保守的，且AT1-box和enhancer是必要的调控元件。

Fig. 1 AT1-box和enhancer控制SCR在豆类皮质细胞中的表达。 

为了研究MtSCR在结瘤中的作用，作者获得了Mtscr突变体。接种根瘤菌后，与野生型相比，突变体的原基、根瘤数和根瘤密度降低，拟南芥Atscr突变体也展现出类似的表型。为了研究异常的根发育是否导致Mtscr中根瘤器官发生的缺陷，作者用由AtSCR启动子（pAtSCR：MtSCR）、MtSCR启动子（pMtSCR：MtSCR）或缺少AT1-box和enhancer（pMtSCR∆En∆AT1：MtSCR）的MtSCR启动子分别驱动MtSCR在各种类型根细胞中表达，发现只有pMtSCR：MtSCR可以拯救结瘤表型。

蒺藜苜蓿基因组编码两个SHR，MtSHR1和MtSHR2。 MtSHR1 / 2 mRNA的表达仅表达于stele中，类似于拟南芥AtSHR的表达模式。为了研究MtSHR1 / 2的生理相关性，作者构建了pMtSHR1：AtSHR-GUS和pMtSHR1：MtSHR1-GUS报告基因，并检测GUS活性。从AtSHR中删除R2（AtSHR-∆R2），但不删除R1，导致其在皮质细胞中非细胞自主积累。此外，用来自MtSHR1的R2（AtSHR-EXR2）替换AtSHR蛋白中的R2也触发了皮质细胞中的非细胞自主累积。表明，R2有助于MtSHR1和AtSHR在蒺藜苜蓿毛状根不同细胞类型中的差异积累。

Fig. 2 MtSHR1 / 2表达于皮质细胞中，是结节共生所必需的。

为研究MtSHR1/2的作用，作者获得了MtSHR2的Tnt1插入突变体（无法获得MtSHR1的突变体）。接种sm1021后，Mtshr2突变体显示出正常的结节器官发生和根发育。值得注意的是，MtSHR1-SRDX的皮质特异性表达减少了结节原基的形成，但没有明显干扰根发育。为了确保SHR-SRDX的积累仅限于皮层，作者将MtSHR1-SRDX融合到两个NLS融合蛋白特异地定位于皮质细胞。 pMtNRT1.3：MtSHR1-SRDX-2NLS的表达仍导致蒺藜苜蓿毛状根的结节形成减少，但根长没有减少。总之，皮层细胞中的MtSHR在根瘤器官发生中起作用。

进一步的，斑点接种实验表明，Sm1021诱导的皮质细胞分裂在Mtscr-1、Mtscr-1Mtscl23和Mtscr-1pAtSCR：MtSCR转化株的根以及在MtSHR1-SRDX转化株的毛状根中均存在缺陷，表明皮层中的MtSCR和MtSHR对于根瘤菌诱导的蒺藜苜蓿皮层细胞分裂很重要。

Fig. 3 皮质细胞中需要MtSHR1 / 2和MtSCR来进行结节器官发生。

植物激素细胞分裂素（6-BA）调节根瘤共生，而6-BA处理足以诱导豆类皮层细胞去分化和分裂，进而形成根瘤原基。用6-BA处理可以激活野生型苜蓿的皮层细胞分裂，但对Mtscr-1，Mtscr-1Mtscl23或MtSHR1-SRDX转化株的毛状根几乎没有影响。表明，进化上独特的SHR-SCR模块可在结节性豆科植物中特定的皮质细胞中作用，这与其他非豆类植物截然不同。

作者发现MtSHR1的过表达改变了苜蓿毛状根中7466个基因的表达。这7,466个基因中有超过40％的基因在接种根瘤菌的紫花苜蓿中也发生了改变。即使在没有根瘤菌存在的情况下，MtSHR1过表达植株的毛状根中也有几个与根瘤菌感染有关的基因上调。表明，SHR-SCR模块在植物发育中采用了一种新功能来适应根瘤菌。

尽管接种Sm1021不会影响MtSHR1 / 2转录本水平，但它会导致紫花苜蓿转基因毛状根，特别是表皮和皮层细胞中MtSHR1-GUS融合蛋白的水平升高。强烈的GUS信号出现在pMtSHR1：MtSHR1-GUS转化株的毛状根的结节发育早期，表明根瘤菌信号导致MtSHR1 / 2升高，进而上调MtSCR，从而增加皮层中MtSHR–MtSCR的活性，从而驱动细胞分裂和结节形成。

Fig. 4根瘤菌共生信号促进表皮和皮层细胞中MtSHR1-GUS蛋白表达。

植生所国家杰青王二涛研究员为该论文通讯作者，WentaoDong为第一作者。本研究得到了中国科学院、国家科学基金会战略重点研究计划“植物生长和发育的分子机制”、中国计划、中国农业部转基因研究、青年创新促进会和Samuel Roberts Noble基金会的支持。

1. Geurts, R., Xiao, T.T. & Reinhold-Hurek, B. What does it take to evolve a nitrogen-fixingendosymbiosis? Trends Plant Sci. 21, 199–208 (2016).

2. Timmers, A. C. J.,Auriac, M. C. & Truchet, G. Refined analysis of early symbiotic steps ofthe Rhizobium-Medicago interaction in relationship with microtubularcytoskeleton rearrangements. Development 126, 3617–3628 (1999).

3. Gauthier-Coles, C.,White, R. G. & Mathesius, U. Nodulating legumes are distinguished by asensitivity to cytokinin in the root cortex leading to pseudonoduledevelopment. Front. Plant Sci 9, 1901 (2019).

4. Cooper, J. B. &Long, S. R. Morphogenetic rescue of Rhizobíum melíloti nodulation mutants bytrans-Zeatin secretion. Plant Cell 6, 215–225 (1994).