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景杰学术 | 报道
以质谱技术为核心的蛋白组学技术，在生命科学研究的各个领域取得了傲人的成果。但是面对蛋白质组学样本的自身复杂性和目前质谱仪采集速度和灵敏度的局限性，怎样提高样本分析通量、定量稳定性以及数据完整性，仍然是一大挑战。
依据定量策略的不同，蛋白质组学技术可分为数据依赖型 (Data-dependent Acquisition, DDA) 策略和数据非依赖采集 (Data-independent Acquisition, DIA) 策略。相较于DDA在一级质谱中在每个时间窗口采集信号较强的有限肽段离子进入二级质谱进行碎裂分析；DIA技术将质谱整个全扫描范围分为若干个窗口，并循环地对每个窗口中的所有离子进行选择、碎裂、检测，可以无遗漏地获得样本中所有离子的全部碎片信息。但传统DIA的数据采集策略会使得谱图高度复杂，给数据解析带来极大的挑战，并且其定量可靠性也存有一定的争议。
针对这一难题，结合离子淌度 (mobility) 分离的4D蛋白质组技术和DIA定量技术的全新一代4D-DIA蛋白质组学 (dia-PASEF®) 应运而生。4D-DIA同时集合了4D蛋白质组和DIA技术的优势，并克服了其原有的一些劣势，能够全面提升蛋白质鉴定能力、检测灵敏度和数据完整性，带来蛋白质组学DIA技术的全面升级，近年来备受瞩目。
近日，北京大学医学部精准医疗多组学研究中心黄超兰团队、中国科学院院士高福团队等在 Nature Communications 期刊上发表题为“Immune suppression in the early stage of COVID-19 disease”重磅研究结果，运用前沿的4D-DIA (dia-PASEF ®) 技术，发现早期的新冠感染患者存在着显著的免疫抑制，并首次提出COVID-19的发病机制或存在“两阶段”模式：第一阶段涉及免疫系统抑制、紧密连接受损以及大规模的代谢紊乱；第二阶段涉及部分免疫应答激活，可能进一步导致细胞因子风暴和器官损伤的发生 [1]。
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无独有偶，12月10日，由全球蛋白质组领域顶尖科学家Matthias Mann教授团队 (Max Planck Institute, Martinsried) 、Ruedi Aebersold教授团队 (IMSB at ETH Zuerich) 、Hannes Röst博士团队 (University of Toronto) 以及Ben Collins博士团队 (Queen's University Belfast) 等共同开发的4D-DIA (dia-PASEF®) 技术研究成果正式在 Nature Methods 刊发，结果展现了4D-DIA技术的强大性能和广泛应用前景 [2]。
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新冠肺炎已成为全球性的大流行病，行之有效的治疗干预措施对疫情的控制至关重要。为深入探索新冠病毒感染后的疾病进展机制，研究者运用前沿的4D-DIA (DIA-PASEF) 蛋白质组学定量技术方法（质谱策略），对来自健康志愿者、COVID-19患者和非COVID-19肺炎患者的尿液样本（样本策略）开展分析。结果显示，与健康志愿者和非COVID-19肺炎患者相比，COVID-19患者体内共有1,986个蛋白发生显著变化，其中大量参与免疫应答和紧密连接形成的蛋白均呈现下调状态。
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图1 蛋白质组学分析流程研究者将COVID-19患者划分为轻中症组和重症组，进一步研究表明，COVID-19的发病机制或存在“两阶段”模式：第一阶段涉及免疫系统抑制、紧密连接受损以及大规模的代谢紊乱；第二阶段涉及部分免疫应答激活，可能进一步导致细胞因子风暴和器官损伤的发生。结果为全面解读COVID-19患者的临床症状提供了可靠的重要分子基础和机制信息，有助于未来进一步探索优化的临床治疗方案设计。基于离子淌度的4D-DIA（DIA-PASEF）新技术
4D蛋白质组学是在传统3D分离即保留时间 (retention time)、质荷比 (m/z)、离子强度 (intensity) 这三个维度的基础之上增加了第四个维度--离子淌度 (mobility) 的分离，进而大幅度的提高扫描速度和检测灵敏度。其中新引入的离子淌度，主要是根据分子的形状和截面进行分离，能够有效降低“混合谱图”的比例。
在4D-DIA (dia-PASEF ®) 的扫描模式中，与离子淌度相关的CCS值和m/z之间有一定的相关性，因此四级杆可以利用这个特征逐步扫描来采集近乎100%的离子信号，极大提升检测的灵敏度和深度。而在DDA和传统的DIA模式中，这些信号只有一小部分可以被采集。除此之外，由于4D平台中新增的离子淌度分离，有效降低了谱图的复杂性，缓解了DIA技术中面临的最大困境。同时，由于同时具有CCS数值的对齐，进一步增强了定量的可靠性。图3 基于4D平台的dia-PASEF ®技术原理与数据采集模式示意图根据实验测试结果，4D-DIA技术表现出极佳的定量深度和数据完整性。在200 ng HeLa 裂解液的120分钟单针实验中，平均鉴定到7,601种蛋白，三次重复共鉴定到7,800种蛋白，定量蛋白质跨越了大约四个数量级的动态范围；并且三次实验的共同定量了7,348个蛋白，数据完整性高达94%。4D-DIA技术还可以进一步挑战检测通量与灵敏度的极限。灵敏度方面，针对10 ng HeLa 裂解液的120分钟单针实验中，共定量到4,310种蛋白，至少在2次重复中定量到的蛋白数量为3,909。高通量检测方面，研究人员使用Evosep One液相色谱系统与tims TOF Pro联合的实验数据表明，当检测通量增加到每天100个、200个样品时，仍然可分别定量到超过4,000个和3,000个蛋白，表明了4D-DIA在保证分析通量的同时，蛋白深度也得到很好的覆盖。综上所述，两篇由国内外蛋白质组学大牛分别发表的4D-DIA技术文章和技术应用文章，展现了4D-DIA技术的卓越性能和广阔的应用前景。全新一代4D-DIA技术能够全面提升蛋白质鉴定能力、检测灵敏度和数据完整性，在高通量和高灵敏度分析中也表现出卓越的稳定性。相信随着其进一步发展与运用，能够为蛋白质组学分析，特别是临床大队列样本分析、作物群体性状等大规模样本的蛋白质组学科学研究，和干细胞、FFPE等微量蛋白质组学科学研究带来更多新的可能。我们也注意到，4D蛋白质组学在技术上突破性的革新成为了行业发展的引擎，已然大势所趋，成为质谱仪器厂商、和技术服务商家的主攻方向。景杰生物4D蛋白质组学平台，在过去的一年间已完成超过8,000个样本的定量分析，陆续开发推出的4D修饰蛋白质组学、4D-DIA、4D-PRM等技术，助力国内外数百家科研单位开展基础科研和临床领域研究运用。[1] Wenmin Tian, et al., 2020. Immune suppression in the early stage of COVID-19 disease. Nature Communications.[2] Florian Meier, et al., 2019. Parallel accumulation – serial fragmentation combined with data-independent acquisition (diaPASEF): Bottom-up proteomics with near optimal ion usage. Nature Methods.
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