eLife| Aβ纤维引发的AD小鼠小胶质细胞的蛋白组变化和功能障碍

       在APPPS1和APP-KI的小鼠模型中，淀粉样斑块沉积出现在相似的年龄段（6-8周）。为了揭示不同淀粉样蛋白沉积阶段小神经胶质蛋白组的动态改变，作者分析了分别来自1，3，6和12个月大的APPPS1和APP-KI小鼠的小胶质细胞，以及其年龄相匹配的野生型（WT）小鼠（图1）。为了便于进行蛋白质组分析，作者首先优化了小神经胶质的分离程序，利用MACS技术从小鼠大脑中分离出CD11b阳性的小胶质细胞，然后，优化了微胶质蛋白组分析的数据采集方法。12个月龄小鼠的APPPS1小胶质细胞显示了776种显著的上调蛋白和633个下调蛋白，而APP-KI小胶质细胞显示了704个上调蛋白和666个下调蛋白。总的来说，数据显示，在这两种小鼠模型中，淀粉样蛋白斑块的积累导致小神经胶质向AD相关表型发展，但是，APPPS1和APP-KI小胶质细胞的反应动力学是不同的。

图1 急性分离的小胶质细胞的定量蛋白质组学

       作者测定了在Aβ蛋白沉积的早期、中期和晚期首先出现的蛋白质改变，以及在所有的分析阶段发生的变化，并一直追踪着淀粉样蛋白的积累。为此，作者选择了APPPS1小鼠模型作为参考，因为它能显示早期的变化，相较于APP-KI，APPPS1小鼠模型能提供一个更好的关于蛋白质改变淀粉样蛋白反应的时间分辨率（图2A）。早期组的小胶质细胞Aβ反应蛋白群（MARPs）包括几个先前确定的转录DAM标记物比如ITGAX (CD11c), APOE, CLEC7a, LGALS3 (Galectin-3) 和CD68 （图2B）；中期组的MARPs包括上调的蛋白质如FABP3, FABP5, CD63, TREM2, MIF 和GUSB（图2C）；晚期的MARPs表达只有在广泛的淀粉样蛋白病理时才会发生改变的蛋白质，该组包括参与钙离子结合的上调蛋白质，比如NCAN,MYO5A, HPCAL4, TTYH1和GCA以及在内吞/溶酶体系统中发挥作用的下调蛋白比如TFEB, TFE3和BIN1，还有不同的G蛋白偶联受体信号蛋白包括GNG2, GNG5和GNG10也显示丰度下降（图2D）。

图2 早期、中期和晚期MARPs

      早期的MARPs基因本体(GO)簇富集分析显示， 上调的蛋白富含免疫反应、病毒反应、干扰素β和细胞因子反应、抗原处理和呈递以及生物和脂质反应（图3）。

图3 MARPs生物过程（BP）的基因本体富集簇分析

      综上，作者的研究提出该组学特征可用来跟踪小胶质蛋白组，并且提供了一种资源，该资源可以在Aβ积累的不同阶段中映射出大脑免疫力的变化。

      作者通过使用从12个月龄的APPPS1和APP-KI小鼠的小胶质细胞中分离出来的小胶质细胞进行Western blot分析，验证了蛋白质组的变化。该分析证实了相较于WT小鼠，在两种转基因小鼠模型中早期MARPs APOE和CD68的明显增加，中位MARPs TREM2和FABP5以及领先的MARP CSF1R的水平降低（图4）。

图4 12个月APPPS1和APP-KI小鼠的定量和调节蛋白

      此外，为了可视化APPPS1和APP-KI小鼠中改变的小胶质蛋白的空间分布，蛋白质组学的变化也通过免疫组化验证。对3个月大的APPPS1小鼠进行免疫组织学分析，已经发现选定的MARP，如CLEC7a（图5），TREM2, APOE的免疫反应性增强，标志着AD中小胶质激活的初始阶段。

图5 小胶质细胞CLEC7a在3个月大的APPPS1小鼠中明显上调

     这些增长在IBA1阳性的小胶质细胞中检测到， 而这些小胶质细胞聚集在淀粉样蛋白斑块上，但在离斑块更远的小胶质细胞中没有，并且在3个月大的APP-KI小鼠中不那么明显（与其蛋白质组数据一致）。据此，与WT小鼠相比，在12个月时，APPPS1和APP-KI小鼠都显示出选定的MARP CLEC7a的水平有类似的增加（图6），TMEM119的水平有所下降。这些数据表明，小胶质细胞和Aβ之间的相互作用很可能触发蛋白质组的变化，因为它们可以在斑块相关的小胶质群体中观察到。

图6小胶质细胞的CLEC7a在12个月龄的AD小鼠模型中均有增加

TMEM119在12月龄的两种AD小鼠模型中均下调

      小胶质蛋白质组的变化幅度与伴随着疾病发展而积累的Aβ斑块有关。尽管在两种小鼠模型中观察到的斑块负荷相同（图1C、D和图2A），但是MARP标记的基因表型在不同的小鼠模型中是不同的，并且在APPPS1小鼠中发生较早。因此，在APPPS1和APP-KI的小鼠模型中，淀粉样蛋白斑块的性质似乎是不同的。在3个月龄的APP-KI小鼠中几乎检测不到纤维素Aβ（图7），APP-KI小鼠中纤维素Aβ的数量在6个月和12个月时增加，但与APPPS1小鼠相比总体上仍然较低。因此，作者展示了APPPS1和APP-KI小鼠模型在3个月龄时Aβ斑块纤维化的突出差异。

图7 与APP-KI斑块相比APPPS1小鼠的Aβ斑块显示出更高的纤维状Aβ含量

      为了确定在AD中是什么原因导致的小胶质细胞的反应，作者首先在两种小鼠模型中量化了小胶质增加到的Aβ斑块，该分析是在早期病理阶段（3个月）进行的，作者发现了蛋白质组调节的突出差异（图1C、D和图2A），以及纤维素Aβ的量都有明显差异（图7A、B）。免疫组织化学分析显示，在APPPS1小鼠中，IBA1阳性的小胶质细胞募集到大的ThR阳性原纤维Ab聚集体中（图8A）。量化分析显示，相较于APP-KI小鼠，在APPPS1小鼠中的Aβ斑块周围，IBA阳性的小胶质聚集增加， 尽管他们的整体较大的Aβ斑块大小支持纤维状Aβ构象导致小胶质的聚集，而不是斑块的大小（图8B、C）。同样，作者观察到，与APP-KI小鼠相比，APPPS1的Aβ斑块周围的CD68免疫反应增加了， 然而，在两个模型中，斑块附近的每个小胶质细胞的CD68信号是相似的。总的来说，作者推测小胶质的增加可能是由淀粉样蛋白斑块的纤维Aβ含量引起的，从而驱动MARP信号的获得。

图9 纤维状Aβ在3个月大的APPPS1小鼠中触发更高的小胶质细胞募集，并与吞噬功能障碍相关

      APPPS1和APP-KI小鼠在小胶质细胞对淀粉样蛋白的反应动力学中观察到的差异促使作者研究小胶质细胞吞噬功能与MARP信号特征之间的关联。为此，作者使用E.coli-pHrodo摄取测定法评估了3个月和6个月大的APPPS1和APP-KI小鼠与相应年龄匹配的WT小胶质细胞的吞噬能力。在3个月大的APPPS1小胶质细胞中检测到吞噬功能障碍，并且能够分离的CD11b阳性细胞数量减少。值得注意的是，APPPS1吞噬功能障碍在6个月大的小胶质细胞中没有进一步改变，这表明通过大肠杆菌摄取测定法测得的小胶质细胞功能缺陷已在3个月大时完全确立，并具有早期MARP的特征。相反，APP-KI小胶质细胞在3个月时仍保持功能，但在6个月时表现出与APPPS1小胶质细胞相似的损伤（图9）。总的来说，作者观察到小鼠模型之间小胶质功能障碍的不同动力学，这与MARP的出现以及原纤维Aβ的存在有关。

      研究表明，小胶质细胞的改变是作为对Aβ沉积的反应而触发的，因为沉积前阶段没有揭示蛋白质组的变化。TREM2-APOE调节机制的改变支持了向MARP的转化。AD小胶质细胞表现出明显的干扰素刺激、抗原递呈增加、细胞表面受体改变、脂质稳态和代谢。小胶质细胞的这些蛋白质组学变化似乎是对纤维Aβ的反应，反映在变形小胶质细胞的形态和吞噬能力受损。作者的蛋白质组数据集提供了一个有价值的研究资源，提供了Aβ沉积不同阶段的小胶质细胞变化信息，未来或许可用于监测小胶质细胞修复策略的治疗效果。

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编 译 / 李传兴

校 审 / 蔡玉洁

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