诺奖得主发表的CRISPR最新、最全的基因编辑研究综述！

许多细菌和古细菌生物使用CRISPR-Cas系统来保护自身免受移动遗传元件侵害。这些CRISPR-Cas系统根据其组成和机制可分为多种类型。目前CRISPR-Cas酶被广泛用于基因组编辑，治疗遗传类疾病。为了充分了解并利用CRISPR-Cas系统的潜能，合理的控制其酶活性时间、持续时间、效率和特异性至关重要。近日，美国加利福利亚大学的分子与细胞生物学系和创新基因组学研究所合作，在《nature chemical biological》上发表了一篇题为 “Controlling and enhancing CRISPR systems” 的综述。此综述讨论了天然CRISPR-Cas调节生物分子的机制，以及如何通过改变酶的功能来增强或者抑制CRISPR-Cas免疫。文章还讨论了CRISPR技术在生物学领域的潜在应用价值。

CRISPR–Cas系统为各种细菌和古细菌提供了对入侵的移动遗传元件(MGEs)的适应性免疫力。这种天然存在的免疫系统已被重新用于基因组工程技术。在CRISPR阵列两侧是多个保守的蛋白编码基因，这些基因在CRISPR介导免疫的不同阶段发挥作用，通常以“ CRISPR关联”(Cas)为前缀。CRISPR-Cas免疫可分为三个阶段：适应、生物发生和干扰。在此综述中，他们描述了CRISPR系统调控的基本机制以及如何增强对自然界和实验室中CRISPR酶的控制能力。

在许多细菌基因组中，CRISPR-Cas系统受到基因调控的转录和转录后模式的控制(Fig. 1和Table 1)。转座子诱变实验发现CRISPR–Cas组装受到多个转录因子控制，除转录因子外，RNA调控机制还能促进或者抑制 CRISPR基因座的表达。

细菌和噬菌体经历了反复的适应和反适应循环，这很可能导致CRISPR系统的多样化。由于这种细菌-噬菌体军备竞赛，噬菌体还进化出了能对抗CRISPR防御系统的蛋白质(Acrs)。与CRISPR–Cas效应子相似，Acrs高度多样化，有约90个不同的家族。Acrs的抑制强度，特异性和机制各不相同，其中大多数抵消了特定CRISPR系统的特定Cas直向同源物。从机理上来讲，Acrs可细分为三个子类：竞争性，变构和酶抑制剂 (Fig. 2 和Table 2)。除了在噬菌体区域内编码的Acrs外，细菌和古细菌基因组还包含CRISPR–Cas基因组附近的辅助调控因子。这些辅助蛋白大多数与靶向RNA的III型和VI型CRISPR系统相关。

III型CRISPR系统包括A–F亚型，对于此系统机制的理解都来源于对III-A和III-B系统的研究。这两个系统的多亚基效应物复合物中均包含Cas10 (在III-A中称为Csm1，在III-B中称为Cmr2)。效应物复合体的Cas10亚基由一个组氨酸-天冬氨酸(HD)核酸酶结构域和两个在结构上类似于聚合酶-环化酶结构域的棕榈结构域组成，其中一个棕榈结构域包含一个催化性GGDD基序(Fig. 3)。Csm6 / Csx1在N端包含一个CARF域，在C端包含一个较高的真核生物和原核生物核苷酸结合(HEPN)域。两种单体的CARF结构域形成高度保守的带正电荷的裂缝，用作cOA结合位点(Fig. 3)。通过III型CRISPR系统的基因组邻近区域时鉴定出许多辅助蛋白，包括Csm6 / Csx1。另一个含有辅助蛋白CRISPR辅助核酸酶1(Can1)的CARF结构域的生化特性表明，它可以通过切割超螺旋DNA来补充III型CRISPR免疫。与Csm6 / Csx1相似，两个CARF域之间的接口构成了cA4结合口袋。结合cA4后，Can1进行结构重排，激活了金属依赖性非特异性核酸酶结构域，该结构域随后形成超螺旋DNA的切口。当DNA发生超螺旋时，Can1的这种活性可用于在复制或转录过程中靶向噬菌体DNA (Fig. 4)。一些III型CRISPR–Cas基因座还包含NucC的同源物，NucC是细菌防御系统基于环寡核苷酸的抗噬菌体信号传导系统(CBASS)的效应子核酸酶。NucC除了在CBASS防御系统中的作用外，还可能作为III型CRISPR途径一部分的辅助核酸酶 (Fig. 4)。此外，通过蛋白质相互作用研究，还鉴定出了核酸酶PNPase和RNase J2，它们与III型CRISPR组分相关，并在能够有效清除病原体的转录本(Fig. 4)。

VI型CRISPR系统是RNA导向的RNA靶向系统，可进一步细分为VI A-D型。这些系统至少包含两个HEPN结构域，但是其位置的序列和结构域组织有差异。VI-B型系统的独特之处在于它们在位点包含辅助跨膜(TM)蛋白(Csx27和Csx28)。Csx28机制的普遍假设是，它充当了额外的反式RNase (Fig. 5b)。VI-D系统还包含辅助蛋白，可增强Cas13d活性。在Ruminococcus Sp中发现RspWYL1，它的N端结构域由一个DNA结合带状螺旋-螺旋基序、一个WYL结构域和一个寡聚C-端结构域组成。尽管详细的机制仍在研究中，但已显示RspWYL1与Cas13d的相互作用较弱，并且对ssRNA具有高亲和力。根据现有证据，可以提出两种模型来实现增强的RNA靶向性。在模型1中，辅助蛋白增加Cas蛋白周围RNA的局部浓度和/或变构刺激Cas活性 (Fig. 5a)。在模型2中，分布了辅助核酸酶，可以增强Cas系统的RNA靶向活性(Fig. 5b)。

CRISPR-Cas蛋白作为转化治疗剂和研究工具的出现要求对它们在时间和空间上的活性进行精确且可调的控制。CRISPR-Cas蛋白具有很高的科学和生物医学价值，它刺激了多种策略的工程设计，更适合于精确控制时空控制其在原核细胞外的表达和活性(Fig. 6)。