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The Plant Journal|印度新德里国家植物基因组研究所在小麦高温适应性取得新进展

植物生物学

高温胁迫严重威胁着植物的生存和全球作物的产量，使得世界范围内粮食安全面临着巨大挑战。面包小麦作为重要的粮食作物，极易受到温度变化的影响，温度升高1℃会使小麦产量下降6%。而小麦生产却能在全球日益变暖的环境下取得成功，这在很大程度上取决于其对高温胁迫的适应能力。迄今为止，植物高温胁迫反应的分子机制已经用转录组学进行了研究，而高温胁迫反应蛋白组的动态变化尚未被研究。

本研究对耐热小麦品种U.Halna细胞质做了蛋白质组学比较分析，从中鉴定了55个HTS应答蛋白（HRPs），它们主要参与新陈代谢和防御途径。通过对细胞质标志蛋白的筛选，作者得到了一种2-半胱氨酸过氧化物酶（以下简称Ta2CP），可能与胁迫感知和适应有关。为了揭示Ta2CP的生理功能，作者研究了Ta2CP如何影响光合作用，特别是叶绿素合成和过氧化物酶状态，以及它如何影响糖-淀粉稳态。结果表明，Ta2CP的沉默导致HTS诱导ROS的高积累，从而导致细胞凋亡。然而，Ta2CP的严格调控可激活细胞防御途径，并与自噬机制协同工作，对HTS诱导的细胞死亡起到保护作用。这些结果表明，Ta2CP是一种对高温胁迫敏感的抗氧化剂，在耐热性中起重要作用。

以下是具体研究结果：

1. 高温介导小麦形态生理变化

作者评估小麦品种U. Halna的耐热程度和适应性生理反应，幼苗在高温胁迫的后期（d-3和d-4）表现出叶片卷曲和变黄。此外，还检测了过氧化氢的丰度和细胞活力对抗过氧化氢的毒性。在d-3和d-4晚期，分别观察到过氧化氢水平的增加和细胞死亡，后期抗氧化酶活性显著降低。在d-4观察到抗坏血酸过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶和超氧化物歧化酶活性降低，而在d-3中过氧化物酶活性降低（图1）。超微结构分析显示，与无胁迫对照组相比，d-4细胞形态发生畸形，同时叶绿体基粒和线粒体嵴未堆积。

图1. 小麦品种U. Halna耐热适应性生理反应

2. 高温胁迫对小麦蛋白质组代谢的影响

为了研究高温胁迫对细胞质蛋白质组的影响，作者分离了细胞质蛋白，通过LC-MS/MS分析鉴定出55种差异表达的蛋白质，称为HTS反应蛋白（HRPs），其中10种蛋白上调，29种下调，16种蛋白呈混合表达模式。主成分分析（PCA）显示，与光合作用和氧化还原稳态相关的HRP在高温胁迫下发生显著变化。此外，为了更好地了解HTS调节的代谢变化，作者比较了d-4和无胁迫对照组的代谢产物分布，在33种非冗余代谢物中观察到差异丰度。糖及其衍生物显示出增加的积累，这表明在高温高压下糖代谢发生了重大变化，这证实了先前观察到的高温胁迫诱导可溶性糖在晚期积累的结果。高温胁迫下糖代谢和不同氨基酸积累的转变也表明，碳水化合物和氨基酸代谢途径之间存在密切联系，以缓解高温胁迫带来的影响，并根据这些发现推测了小麦中的高温胁迫响应网络（图2）。

图2. 小麦中的高温胁迫响应网络

3. 高温胁迫响应蛋白Ta2CP的组学鉴定分析

作者在对HTS反应蛋白组中潜在靶点进行筛选时鉴定了Ta2CP，该蛋白表达增加，尤其是在d-4组中。为了进行亚细胞定位，作者分离了叶绿体组分，并检查了Ta2CP与叶绿体特异性标记物、捕光复合物、RuBisCO L亚基和线粒体特异性标记细胞色素c氧化酶的存在。与全细胞提取物相比，在叶绿体富集部分发现了丰富的Ta2CP，进一步证实了其在叶绿体中的定位。

4. Ta2CP在酵母突变体中的异源互补及其在拟南芥中的高表达

巯基特异性抗氧化蛋白（TSA1和TSA2）是酵母中的植物2CP同源物，参与氧化还原平衡。TSA1/TSA2单独或同时破坏已被证明会导致酵母生长缺陷。为了确定Ta2CP的功能作用，作者用pYES-DEST52:Ta2CP对酵母中的单突变体Δtsa1和Δtsa2以及双突变体Δtsa1Δtsa2进行了互补实验，发现Δtsa1Δtsa2双突变体的生长缺陷较严重，其次是Δtsa1。重要的是，互补系（Δtsa1:Ta2CP，Δtsa2:Ta2CP和Δtsa1Δtsa2:Ta2CP）在非胁迫条件下表现出更好的表型（图3）。在高低温、高盐、渗透和氧化胁迫下观察到Δtsa1Δtsa2:Ta2CP中生长缺陷的功能互补和修复，证实了Ta2CP能够补充酵母TSA的功能，并提供多重胁迫耐受能力。

对Ta2CP过表达拟南芥植株的进一步研究显示，在非胁迫和高温胁迫条件下，其表现出绿色和健康的表型，表明与野生型生态型Col-0相比，Ta2CP在过表达系中的耐热性中起作用，表明Ta2CP具有跨域适应性反应。

图3. Ta2CP在酵母突变体中的异源互补和在拟南芥中的过表达

5. Ta2CP在植物发育和耐热性中的作用

作者通过VIGS诱导的基因沉默发现，Ta2cp沉默植株中Ta2CP的表达显著降低，从而导致类似光漂白的表型、受损的叶片形态和株高的降低。暴露于高温胁迫条件下，Ta2cp沉默植株防御能力受损。而Ta2CP过表达的植株表现出更好的生长和发育，Ta2CP表达增加。为了解释Ta2CP在耐热性中的作用，作者将Ta2cp沉默和Ta2CP过表达的植株暴露在高温胁迫条件下，Ta2cp沉默的植株表现出广泛的卷曲和萎蔫，而Ta2CP过表达的植株表现出适合高温胁迫条件下生长的表型。进一步分析Ta2CP在叶绿素代谢中的作用，Ta2cp沉默植株中的叶绿素显著减少，尤其是高温条件下的叶绿素a，这与类似光漂白的表型一致。Ta2CP高表达植株的叶绿素a和b含量明显高于载体转化植株。值得注意的是，HTS诱导的增加仅在叶绿素a中观察到，而在Ta2CP过表达的植株中没有观察到对叶绿素b的显著影响。

6. Ta2CP与TaPORB相互作用，参与叶绿素的生物合成

鉴于Ta2cp沉默和过表达植株之间叶绿素含量的差异，有必要对Ta2CP在叶绿素生物合成中的作用进行剖析，并探索到在这一途径中与其相互作用的因子。为了深入了解Ta2CP对叶绿素生物合成的影响，作者研究了其可能的相互作用伴侣，特别是谷氨酸-1-半醛-2,1-氨基变位酶（GSA）、原叶绿素还原酶B（PORB）和黄嘌呤原Ⅲ氧化酶（CPO）。对Ta2CP沉默和Ta2CP过表达的植物中它们转录物的相对丰度进行定量分析，作者发现Ta2cp沉默植株中PORB转录物的减少，Ta2cp过度表达植株中PORB却显著增强（图4a，b）。此外，TaCPO在Ta2CP过度表达的植物中表现出增加的表达，而在Ta2cp沉默的植株中没有发现任何影响。此外，在Ta2cp沉默或Ta2CP过度表达的植株中，GSA的转录丰度没有表现出相关性。

接下来，作者通过Y2H（酵母双杂交实验）分析来确定Ta2CP是否与候选伴侣TaGSA、TaPORB和TaCPO相互作用。结果表明，Ta2CP与TaPORB发生物理作用，并通过双分子荧光互补（BiFC）分析进一步证实了这种相互作用。TaPORB-YFPc和Ta2CP-YFPn共表达导致叶绿体中出现明亮的YFP荧光，表明Ta2CP和TaPORB之间存在相互作用（图4d）。但与TaPORB-YFPc和YFPn或Ta2CP-YFPn和YFPc共转化叶片时，未观察到荧光现象。

图4. Ta2CP与TaPORB相互作用验证

为了进一步探讨Ta2CP在光合作用中的作用以及Ta2CP与TaPORB的关系，作者对小麦TaPORB进行了沉默处理。与载体对照相比（TRV:00），Taporb沉默植株表现出生长迟缓和淡绿色表型，Taporb表达显著降低（图4e，f）。有趣的是，沉默TaPORB导致Ta2CP转录物水平降低，这与Ta2cp沉默植株中PORB的下调有关（图4a，f）。通过对Taporb和Ta2cp沉默植株测定原叶绿素含量，分析发现Ta2CP与TaPORB在原叶绿素向叶绿素a的转化过程中起协同作用，在叶绿素生物合成中起着关键作用。

7. Ta2CP介导的淀粉生物合成效应

植物积累淀粉作为短暂和长期的碳水化合物储备，维持碳供应以应对多种生理需求，包括胁迫反应。Ta2cp沉默和过表达的植株分别表现出高和低淀粉含量。为了解释这一现象，作者量化了淀粉生物合成的关键调节因子AGPase的转录丰度。在非胁迫和高温胁迫条件下，Ta2cp沉默的植株中AGPase1的表达增加，而在高温胁迫下，AGPase2表达增加。此外，在Ta2CP过度表达的植株中发现AGPase1和AGPase2表达降低。

8. Ta2CP刺激抗氧化途径，降低氧化应激反应

由于Prxs在过氧化氢和脂质过氧化物的解毒中起作用，并且已知它们与其他过氧化物去除酶一起作用（Dietz，2016）；因此，我们检查了在非压力和高温下沉默和过度表达2CP对Ta2cp沉默/Ta2cp过度表达植物中其他过氧化物酶状态的影响。与对照组相比，Ta2cp沉默植株的过氧化物酶活性增加（~67%）。在非胁迫条件下，Ta2CP过表达植物的过氧化物酶活性变化可忽略不计（~8%），而在高温胁迫条件下，过氧化物酶活性增加（~23%）。一般来说，过氧化物酶的活性除了Prxs外，还与APx和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）有关。因此，为了研究沉默和过度表达Prx、Ta2CP对其他过氧化物酶和Prx转录丰度的影响，作者分析了Ta2CP沉默和过表达植物在非胁迫和高温胁迫条件下过氧化物酶和Prx的转录丰度。过氧化物酶的转录本如PrxIIB、PrxIIF、APx7和GPx在非胁迫条件下上调或保持在稳定状态。在HTS处理的Ta2cp沉默植物中，TaPER1、GPx、TaPrxQ和TaAPx2的表达增加。此外，PrxIIB、PrxIIE、PER1、PrxIIF、PrxQ、APx7和胞质GPx的转录丰度与HTS处理的Ta2CP过表达植物的过氧化物酶活性增加呈正相关。

原文链接：

https://doi.org/10.1111/tpj.15119

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