Neuron： 血管ApoE4通过调节胶质细胞的血管功能引起认知损伤
以下文章来源于小崔和他的小伙伴们 ，作者天珍 春梅
欢迎关注崔理立课题组公众号！ 本公众号重点关注神经相关疾病最新研究进展！ 科研小作坊，既是学习也是共情。交个朋友，一起玩耍，随性而为，和而不同! -崔理立
导 读：
在人群中载脂蛋白E基因(APOE)的多态性是由三个不同的氨基酸的多态性而产生三种不同的亚型 (apoE2、apoE3和apoE4)，他们有着不同的生化特性和功能。而apoE4大大增加了阿尔茨海默病 (AD) 以及认知功能减退等相关神经疾病的发病风险。此外APOE4也与小血管疾病、血管性认知障碍(VCI)密切相关。因此探寻apoE4损害脑血管功能的机制将有助于更好地理解apoE的病理变化，并识别apoE4相关疾病的潜在机制。《Neuron》期刊上近期发表了题为“Vascular ApoE4 Impairs Behavior by Modulating Gliovascular Function”的研究报告，作者团队通过在血管壁细胞 (vmc)中表达人类apoE亚型的条件小鼠模型，探讨血管apoE对脑血管功能和脑认知的影响。作者发现VMC中apoE4的表达会导致小动脉血流和行为的损伤，而VMC中apoE3的表达则不会。血管和胶质细胞的单细胞RNA测序显示，VMCs中的apoE4与星形胶质细胞激活有关，而apoE3与外周细胞的血管生成特征有关。研究结果提示了血管APOE对AD发病机制的重要贡献。
1.血管壁细胞(VMCs)表达的ApoE小鼠改善了其高胆固醇血症和动脉粥样硬化表型
作者首先建立小鼠模型，将含有“loxP-flanked 与人APOE3或APOE4”基因的小鼠（如图1A中ROSA-APOE3小鼠）与含有Cre重组的小鼠（SM22a-Cre小鼠）杂交，得到的小鼠再与APOE-KO的小鼠杂交，最终得到iE/Cre-和iE/Cre+的小鼠。ApoE基因敲除的血管壁细胞中表达人类APOE3或APOE4的小鼠，分别命名为iE3/Cre+小鼠或iE4/Cre+小鼠，阴性对照鼠为iE3/Cre-小鼠或iE4/Cre-小鼠(图1A). 作者使用免疫荧光证明上述小鼠的血管壁细胞确实表达APOE3、APOE4。用替代靶基因表达的绿色荧光蛋白(GFP)和apoE免疫染色证实了iE/ Cre+小鼠血管周细胞中APOE3或APOE4的表达(图1B)。此外，通过GFP信号与a-平滑肌肌动蛋白共定位证实了血管壁细胞特异性转基因表达(图1C)。 之后作者测定上述小鼠血浆和大脑皮层的APOE的含量，发现iE3/Cre-小鼠的APOE含量＜iE3/Cre+小鼠的APOE含量＜APOE3/TR小鼠的APOE含量,APOE4的规律类似 (图1DF)，这些结果验证了我们的iE/Cre+小鼠血管壁细胞中apoE的特异性表达。作者再次测定血浆中总胆固醇的含量，结果发现iE3/Cre-小鼠的总胆固醇含量＞iE3/Cre+小鼠的总胆固醇含量＞APOE3/TR小鼠总胆固醇含量，而APOE4的规律也类似(图1EG)，这些结果证实了iE/Cre+小鼠VMCs中apoE可改善小鼠的高胆固醇血症。此外iE/Cre+小鼠主动脉窦动脉粥样硬化斑块尺寸明显低于iE/Cre-老鼠(图1J-M)。
综上所述，血管壁细胞(vmc)中表达的ApoE可改善ApoE 基因敲除小鼠的高胆固醇血症和动脉粥样硬化表型。
2.ApoE4在VMCs中的条件表达可导致焦虑样行为增加、空间学习功能受损和突触可塑性受损
为了明确血管壁细胞表达的apoe4对焦虑行为的影响，作者开展了焦虑的行为学检测试验。结果显示iE3/Cre+小鼠上述统计量与iE3/Cre-小鼠相比无统计学意义，说明iE3/Cre+小鼠与iE3/Cre-小鼠相比，未见焦虑样行为(图2A、2B、2C)。在开放试验(OFA)中，iE4/Cre+小鼠与iE4/Cre-小鼠相比焦虑样行为增加。(图2D、2E、2F)。在水迷宫(MWM)测试中，与iE4/Cre-小鼠相比，iE4/Cre+小鼠在隐藏平台训练中到达平台的距离更远，说明iE4/Cre+小鼠在空间学习方面存在缺陷，但在记忆保留方面没有缺陷。同理，与iE3/Cre-小鼠相比，iE3/Cre+小鼠的空间学习和记忆保持能力没有出现缺陷(图2G、2I)。在进一步评估突触可塑性是否受损的实验中，作者测量长期增强(long- long potentiation, LTP)的指标，结果发现iE4/Cre+小鼠的突触可塑性受到抑制(图2J)，但iE3/Cre+小鼠没有受到抑制(图2H)，这说明VMCs产生的apoE4会导致突触可塑性受损。这些数据表明，血管apoE4表达与焦虑样行为增加、空间学习受损和突触可塑性受损有关。
图2：VMC-特异ApoE4增加了焦虑样行为、影响空间学习和突触可塑性
3.Apoe4在VMCs中的表达导致脑小动脉血流的减少
脑血流(CBF)受损、胶质血管细胞功能障碍和血脑屏障(BBB)破坏是认知障碍的关键因素。为了深入了解vmc源性apoE4损害行为的潜在机制，作者对血管壁细胞条件性表达APOE4的小鼠的血管完整性和功能进行评估。通过体内双光子显微镜，作者发现iE4/Cre+小鼠的CBF速度明显低于iE4/Cre-小鼠，而iE3/Cre+小鼠的CBF速度iE3/Cre-小鼠的CBF速度无明显差别(图3B)，这些结果表明，apoE4的血管表达与CBF的减少有关，可能导致了血管apoE4对大脑稳态和行为的有害影响。
图3：VMC特异ApoE4对脑血流的影响
4.Apoe4在VMCs中的表达可调节胶质血管单元的多种细胞类型的转录组特征
为了研究vmc衍生的apoE亚型如何影响胶质血管细胞的分子表型，作者对iE3/Cre-、iE3/Cre +、iE4/Cre-、iE4/Cre+老鼠的胶质血管细胞进行单细胞RNA测序。超过15个细胞群被识别出来，包括星形胶质细胞、周细胞、平滑肌细胞、脉络丛细胞、内皮细胞、成纤维细胞和其他类型的细胞，并且对这些细胞进行标记和注释(图4ABC)。
作者通过基因测序，对上述四种小鼠的15种细胞的上调和下调进行分类统计其差异性表达的数量，发现iE3/Cre+小鼠平滑肌细胞簇上调与iE3/Cre+小鼠平滑肌细胞簇上调是一致的(图4DE中箭头所示) 。在iE3/Cre+小鼠中差异性表达数量最多的是周细胞(图4D)，与图4E中iE4/Cre+中周细胞相比，iE3/Cre+小鼠周细胞明显增多，说明iE3/Cre+小鼠周细胞中血管生成的潜能增加。相反如图4DE，“Astrocyte_2”在iE3/Cre+中明显比iE4/Cre+小鼠要低，说明iE4/Cre+小鼠对胶质胶质细胞生成正向调控。最后作者对iE3/Cre-, iE3/Cre+, iE4/Cre-, iE4/Cre+四种小鼠的冠状脑切面进行免疫染色，GFAP抗体的免疫染色(红色)，EGFP信号(绿色)分别表示iE3/Cre+或iE4/Cre+小鼠中apoE3或apoE4的表达，结果显示在iE4/Cre+小鼠中贯穿小动脉周围的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫反应性显著高于iE4/Cre-小鼠(图4G)。这和上述结果一致，说明血管壁细胞衍生的APOE4调节了胶质血管等细胞的转录组特征。
图4：VMC特异ApoE4影响血管单元内多种细胞类型的转录信号
小结
综上，该研究证明了VMC衍生的APOE亚型在不同程度上调节胶质血管的功能和行为。鉴于由VMC-ApoE4诱导的表型重述了那些全身表达ApoE4的表型，结果提示血管ApoE4对AD和VCI的发病机制有重要贡献。
END
审 校：梁春梅
长按关注
“小崔和他的小伙伴们”