CCS Chemistry | 向蛋白质学习，PNIPAM高分子单链纳米粒子实现水相制备、折叠可控

蛋白质因其独特的多层次、精确的分子内折叠结构以及由此带来的丰富功能一直受到生命科学、化学和物理学家们的关注。受其启发，高分子化学家通过单分子纳米技术，将单链高分子进行链内折叠发展了一类新型纳米物质--单链纳米粒子（single-chain nanoparticle, SCNP）。SCNP一般具有10 nm以下的粒子尺寸，同时保留了高分子前驱体链所特有的柔性可形变及刺激响应能力。此外SCNP可作为研究蛋白质折叠的理想模型，对加深蛋白质、DNA等生命关键物质的多级折叠结构与性能间关系的理解具有重要意义。

图1 用官能团修饰聚合物前驱体链，当在稀溶液中触发官能团反应时，将促进链内折叠过程的发生。(此图来自 Frank P, et al., Appl. Petrochem. Res., 2015, 5, 9–17.)

SCNP通常由前驱体高分子的分子链内交联反应获得（见图1）。为了保证交联反应仅在分子链内发生，往往需要在极稀溶液条件下实现。而高分子链在良溶剂中通常符合自规避行走模型，即链内交链反应通常先发生于链的局部，由此制备的SCNP缺乏对内部折叠结构的有效控制。且合成的大部分SCNP具有局部交联而整体开放、松散的结构，与天然蛋白所具有的紧密折叠结构相比存在差异。如何获得具有紧实内部折叠的类蛋白结构，并且进一步实现对SCNP分子内折叠程度及结构的系统控制是尚待解决的重要科学问题。

图2 前驱体链及对比样品PNIPAM, PEG-PNIPAM, ABP-PNIPAM 和 PNAE的合成

图3 (a) 在1 mg/mL的水溶液中，利用DLS测得的PNIPAM、PNAE-5.3、PNAE-10.5和PNAE-12.8的流体力学半径Rh的温度依赖性; (b) 利用¹H DOSY NMR测得的PNAE-12.8的扩散系数，并结合Stokes–Einstein 方程计算获得的不同温度下的Rh； (c, d) 在298k时，PNAE-12.8分别在氘代氯仿 (c) 和重水(d)中的¹H NMR (500mhz) 谱图(顶部)和¹H NOE谱图(中部和底部)。左上角的分子结构中的字母标示了该谱图中的信号所对应的质子

将SCNP的前驱体高分子链在交联前进行预塌缩不仅可用于解决SCNP的可控折叠问题，更重要的是可用于制备具有密折叠的球形类蛋白SCNP结构。早期研究表明聚（N-异丙基丙烯酰胺）（PNIPAM）在极稀水溶液中随着温度的升高会发生基于氢键断裂的亲疏水性的改变，发生单分子尺度的coil-globule转变。这种基于温度的构象转变可以作为控制高分子单链折叠结构的有力工具。吉林大学钱虎军教授和赵环宇副教授合作，利用PNIPAM作为前驱体链，并利用光交联反应，成功实现了具有从松散到密折叠结构的温敏型单链纳米粒子SCNP的水相制备。作者在实验中设计了含疏水性光交链基团二苯甲酮和亲水性的寡聚乙二醇的三元无规共聚PNIPAM前驱体链，并研究了系列前驱体链随温度变化的行为。通过¹H核磁NOE谱的构象分析，作者发现对比良溶剂氘代氯仿中的无耦合，在氘代水中的前驱体链主链中的氢发生明显的靠近，说明在水溶液中前驱体链发生了塌缩。在水溶液的变温实验中，随着温度的升高，前驱体链的流体动力学半径R_h逐步变小直至32℃后保持恒定。这些结果说明，合成的前驱体链在水中发生了预折叠，并且其折叠程度可以用温度进行调控。在水溶液中通过控制反应温度并利用光引发交联制备不同SCNP并进行表征后发现，不同温度下合成的SCNP流体动力学半径与前驱体链表现出相同的变化趋势。结果表明，随着温度的升高，前驱体链发生程度越来越大的单分子塌缩，而超过32℃后其分子塌缩到紧实状态不再发生进一步折叠。这些结果在分子动力学模拟中得到了进一步证实。而通过对前驱体和相应SCNPs的流体动力半径和分子量分布进行理论标度分析的结果表明，在高于PNIPAM临界转变温度下合成的SCNPs确实具有类蛋白完全折叠结构。此外，合成的SCNP保留了前驱体链的温敏性质，随着温度的变化SCNP的尺寸发生明显的热缩冷涨行为。

图4 （a）PNAE-12.8与在不同温度下合成的单链纳米粒子的SEC曲线。（b）PNAE-10.5与在不同温度下合成的单链纳米粒子小球的SEC曲线。(c)不同温度下获得的SCNP-10.5和SCNP-12.8纳米粒子的重均分子量。（d）288K下获得的SCNP-12.8纳米粒子的TEM图像，纳米粒子经OsO4染色，溶液浓度在1mg/ml

图5 单链纳米粒子的合成路线及其在水溶液中的温敏行为示意图

图 6 （a） PNAE-12.8与SCNP-12.8@288K的温度依赖性：在不同温度下利用1H DOSY NMR光谱法测试获得扩散系数并结合Stokes–Einstein方程计算获得的R_h数据。(b) 分子动力学模拟：紫色方块和蓝色圆圈分别代表纯PNIPAM和PNAE前驱体在不同温度下由舒展状态到坍缩状态的变化。绿色三角曲线代表不同温度下链内交联反应的SCNP的R_g的变化。橙色菱形代表在320K反应的SCNP在降温时R_g的大小变化。并行虚线是SCNP@320K的理论溶胀最大值

综上所述，该研究工作提供了一种简单易行的用于控制单链纳米粒子内部折叠结构的新策略，该论文的第一作者是吉林大学超分子结构与材料国家重点实验室的张合博士，文章中的电镜照片由杭州师范大学的由吉春教授及研究生张良提供。本研究得到了国家自然科学基金委及吉林大学创新团队项目的支持，文章以research article的形式发表在CCS Chemistry，并在官网 Just Published上线。