【人物与科研】浙江大学苏彬教授课题组：电化学发光显微镜用于活细胞的细胞-基质黏着和细胞集体迁移成像

苏彬教授课题组聚焦于电化学发光方法和技术、微纳尺度分子分离和分析等研究方向，开展时空分辨电化学发光、电化学发光免疫/分子诊断、微界面仿生传感分析等方面的基础和应用研究。

浙江大学化学系教授，浙江大学分析化学研究所所长。主要从事界面电化学、光电化学测量与成像方法/技术、微纳尺度分子分离和分析、指纹识别与痕迹检验分析等方面的基础和应用研究。迄今共发表论文130余篇，其中IF>10的17篇（含7篇J. Am. Chem. Soc., 6篇Angew. Chem. Int. Ed., 2篇ACS Nano），IF>5的50余篇；获授权中国发明专利9项。指导研究生30余名，其中1名获教育部博士研究生学术新人奖，1名获浙江大学竺可桢奖学金，4名获国家奖学金。

图1. 电化学发光细胞黏着显微成像原理

（来源：Angew. Chem. Int. Ed.）

在进行ECL细胞成像时，需要预先将细胞孵育在SNM修饰的ITO电极上。该电极可实现三联吡啶钌（Ru(bpy)₃²⁺）/共反应剂电化学发光两个数量级的增强。实验中选择4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）作为共反应剂，它也是一种生物缓冲剂，可在开放式细胞培养环境中有效控制溶液pH。将Ru(bpy)₃²⁺和HEPES加入PBS溶液中，在电极上施加合适的电位，无细胞处电极表面发生如式1-6所示的反应，释放出光子，发光位点在图像中表现为明亮区域。

其中B（buffer）和B^•分别表示HEPES及其自由基中间体，P是B^•均相氧化反应的产物。细胞黏着与SNM表面接触，抑制Ru(bpy)₃²⁺和HEPES扩散到基底ITO电极表面，发光较弱，呈现为灰暗区域，即得到细胞黏着的反相电化学发光图像。

图2为PC12细胞透射明场和相应的ECL图像。两种成像模式中细胞轮廓基本对应，但差异也较明显。ECL图像中可清楚观察到明场模式中模糊的细胞结构（白色箭头所示），例如细胞突起（图2d）、伪足（图2e）、卷边（图2f右侧）以及一些类似于黏着斑的短且有序的细胞结构（图2f左侧）。此外，细胞ECL图像中并非所有区域都是暗的（如白色圆圈所示），其灰度值接近于无细胞区域的亮背景值。这是由于细胞底部不会全部形成黏着结构，非黏着区域发光不受抑制。

图2. PC12活细胞的明场（a-c）和相应的ECL图像（d-f）

（来源：Angew. Chem. Int. Ed.）

胰酶可以消化细胞黏着，使细胞从基底上脱离。作者以胰酶消化为模型，利用ECL成像对黏着动态变化进行了研究。图3比较了单个PC12细胞的明场和ECL图像。加入胰酶三分钟后，明场中观察到细胞上部缩回变圆（图3b），ECL图像中细胞上部较为疏松的黏着结构消失，下部较为紧实的结构基本保持原状（图3e）。六分钟后，明场中细胞上部继续变圆（图3c），ECL成像显示黏着区域逐渐变小（图3f）。细胞处于均匀的胰酶溶液中，且不受其他外力的干扰，因此，作者认为在此条件下得到的结果能够表征细胞黏着的强度。细胞上部的黏着强度较低，易被消化；而下部强度较高，不易被消化。

为了研究细胞消化速率和黏着形态的关系，作者定义消化速率为单位时间内单个细胞黏着面积的变化量。黏着面积相同的细胞，消化速率越大，黏着强度越低。图3g-i分别是PC12细胞消化速率与细胞黏着面积、周长和Feret's直径的关系。结果表明，消化速率与这三个参数均呈现正相关关系，皮尔逊相关系数（PCC）分别为0.949，0.798和0.782，即消化速率与黏着面积相关性最高。黏着面积越大，意味着黏着蛋白与胰酶的接触面积越大、反应截面越大，反应速率也越高。此外，对比Huh-7细胞的胰酶消化实验结果，Huh-7细胞的平均消化速率低于PC12细胞，且前者ECL图像的灰度值也低于后者。较低的ECL图像灰度可能归因于较高的黏着强度。由此说明，在无胰酶的情况下，可以通过ECL灰度大致判断黏着强度。

图3. 胰酶消化单个PC12细胞的明场（a-c）和ECL图像（d-f）：（a, d）0 min，（b, e）3 min，（c, f）6 min。（g-i）单细胞胰酶消化速度和细胞黏着面积（g）、周长（h）及Feret's直径（i）的统计关系

（来源：Angew. Chem. Int. Ed.）

细胞黏着在细胞集体迁移中起到关键作用。人们对单个细胞在迁移过程中的黏着变化已经有了较为清楚的认识。但细胞集体迁移过程中，细胞群体如何感知迁移方向，“leader”细胞和“follower”细胞起到何种作用，目前尚未有定论。下面作者将ECL成像用于细胞集体迁移黏着分析。

对比划痕实验中不同时刻的细胞明场和ECL图像，细胞迁移0 h和2 h拍摄的明场图像中细胞均无序分布（图4a和b），而在ECL成像中，细胞黏着展现出明显的朝向划痕方向的迁移倾向（图4d）。为了描述细胞定向迁移，作者对明场和ECL图像的矢量场分布进行了分析，如图4c、d中红线和e、f中的黑色箭头所示。图4g和h将矢量场分布以彩图形式展示，可以明显观察到两个时刻矢量分布的差异：g图中矢量场分布界限清晰，平行于划痕边界，h图中同一位置的矢量场较多垂直于划痕方向。明场图像分析则无法得到这一结果。同样地，作者对细胞迁移4–12 h得到的ECL图像的矢量场进行了分析，统计结果如图5所示。

图4. 细胞划痕实验中单层PC12细胞的明场（a, b）和ECL图像（c, d）。图c和d中的红线代表局部细胞取向，图e、f和g、h分别将其以有向箭头和彩图的形式展示。第一列图像（a, c, e, g）在划痕后立即采集，第二列（b, d, f, h）在细胞迁移2小时后采集。

（来源：Angew. Chem. Int. Ed.）

定义方向在±45°范围内的矢量为“方向性矢量”，其表征了细胞向划痕迁移的倾向。如图5a所示，当迁移开始后，方向性矢量的比例在划痕附近较高并出现平台，距划痕越远，方向性矢量比例越低。随着迁移时间的延长，平台的范围越来越大。定义方向性矢量比例大于80%的范围为“方向性距离”。如图5b所示，该距离随时间延长，且远远大于细胞迁移的距离。例如迁移12 h时，方向性距离约为350 mm，而迁移距离仅有100 mm。这说明不仅仅是划痕边缘正在迁移的细胞决定了迁移方向，远离划痕的细胞也已调整方向，做好迁移准备。这一结果强调了“follower”细胞在迁移中的作用，它们并不是被动的跟随者。

图5. （a）方向性矢量比例随距划痕的距离变化；（b）方向性距离（黑色）和迁移距离（划痕实验得到，蓝色）随时间变化

（来源：Angew. Chem. Int. Ed.）

该工作构建了细胞-基质黏着的免标记电化学发光成像体系，研究了亚细胞水平细胞黏着的动态变化及单细胞水平黏着强度与黏着形态的关系，并对集体迁移中方向性迁移的细胞进行了成像分析。该研究成果近期发表在Angewandte Chemie International Edition （DOI: 10.1002/anie.201911190）上，论文通讯作者为浙江大学化学系苏彬教授，第一作者为苏彬教授课题组在读博士生丁昊，共同第一作者为浙江大学在站博士后郭维亮博士。该工作得到了国家自然科学基金和浙江省自然科学基金的资助，在此表示感谢！

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