端粒酶是由RNA模板部分，逆转录酶催化成分（TERT蛋白）和相关蛋白组成，是肿瘤鉴定的重要生物标志物。它在细胞周期复制阶段在染色体端粒末端合成端粒重复序列，因此端粒酶的表达水平随着细胞周期的发展而变化。尽管在检测TERT mRNA和活性端粒酶的活性方面已进行了许多努力，但细胞周期的异质性行为却被忽略了，这可能会影响其检测结果的准确性。
中国地质大学娄筱叮团队基于聚集诱导发光（AIEgen）的荧光检测系统，研究了细胞周期进程（G0/G1，G1/S，S和G2/M期）在分析癌细胞中的端粒酶（TERT mRNA和端粒酶活性）的作用。如示意图1，没有TERT mRNA和Exo III的情况下，多余的PyTPA-DNA探针可以互补杂交，然后被核酸外切酶III（Exo III）裂解以释放靶标和氟（PyTPA-N3）。活性端粒酶存在时，模板链引物（TP）可以延伸以形成长的带负电荷的DNA链，带正电荷的AIE染料（Silole-R）通过静电相互作用自发结合到链上。作者测试了癌细胞与正常细胞不同阶段之间的TERT mRNA和端粒酶活性，并比较了细胞周期不同阶段中某些生物标志物的表达水平，结果表明，有关肿瘤生物标志物分析应考虑细胞周期的阶段。该研究以题为“Role of cell cycle progression on analyzing telomerase in cancer cells based on aggregation-induced emission luminogens”的论文发表在《National Science Review》上。示意图1. 基于AIEgen的荧光检测系统，用于分析细胞周期不同阶段的TERT mRNA和端粒酶活性。首先制备PyTPA-N3，然后与Alk-DNA偶联生成PyTPA-DNA（图1A）。HRMS和UV-Vis光谱证明PyTPA-DNA成功合成（图1B、C）。PyTPA-DNA的荧光强度随着浓度从0到1000 pM的增加而逐渐增强，并呈线性相关（图1E）。基于静电力，Silole-R能够与带负电荷的DNA骨架相互作用（图1F）。荧光发射与细胞提取物之间呈正相关关系，随着HeLa细胞从0增加到10000，TP和Silole-R的荧光强度逐渐增强（图1G）。该生物探针具有高特异性，只有活性端粒酶能引发荧光（图1H）。图1. PyTPA-DNA和Silole-R生物探针在分析TERT mRNA和端粒酶活性中的可行性分析。（A）PyTPA-DNA的合成路线。（B）PyTPA-DNA的HRMS。（C）PyTPA-N3和PyTPA-DNA的UV-Vis光谱。（D）水解产物PyTPA-G的HRMS。（E）随着靶标浓度的不同，荧光反应逐渐增强。（F）Silole-R和磷酸盐残基之间的静电相互作用。（G）Silole-R与不同浓度的端粒酶提取物一起孵育的荧光反应。（H）在相同的实验条件下，端粒酶对不同蛋白质的荧光响应（I/I0）-1。作者通过处理血清饥饿，L-含羞草碱，胸苷和诺考达唑获得四个阶段的HeLa细胞（图2A）。然后根据DNA含量，以流式细胞术分析鉴定出相应的同步细胞组分（图2B）。首先，使用PyTPA-DNA和Silole-R生物探针来研究HeLa细胞在不同细胞周期下TERT mRNA的表达和端粒酶活性。在整个细胞周期中，PyTPA-DNA在G0/G1期微弱发荧光，G1/S期响应时荧光增强 S期荧光最强，G2/M期细胞的荧光最弱（图2C）。HeLa细胞中TERT mRNA表达呈现细胞周期依赖性（图2D），端粒酶活性也有类似响应（图2 E）。TRAP分析表明S期表达水平最强（图2 F）。说明来自不同癌细胞周期提取物的TERT mRNA量和端粒酶活性与细胞周期有关。两种探针孵育细胞后，由于细胞活性增加，在大多数所有细胞上均观察到细胞荧光强度的增强，且G1/S和S期中红色荧光和蓝色荧光均逐渐增加（图2 G）。对于用胸苷处理的HeLa细胞的荧光，在S期显示最高值，在G2/M期显示相对较低的值，在G1/S和G0/G1阶段显示几乎相同的信号（图2 J-L）。结果表明，细胞周期对TERT mRNA和端粒酶活性的定位具有显着影响，其中S相特异性增强和G2/M相特异性降低人癌细胞中TERT mRNA和端粒酶活性。图2.（A）简短的实验程序说明。（B）细胞在G0/G1，G1/S，S和G2/M阶段同步。（C-D）通过PyTPA-DNA生物探针和qPCR对HeLa细胞中TERT mRNA的定量。（E-F）使用Silole-R生物探针和TRAP方法定量HeLa细胞中的端粒酶活性。（G-I）不同HeLa细胞中G0/G1，G1/S，S和G2/M期的TERT mRNA和端粒酶活性及其相应的荧光强度同步的图像。（J-L）G1/S，S，G2/M和G0/G1期同步的不同HeLa细胞中TERT mRNA和端粒酶活性的图像及其相应的荧光强度。【临床组织样品中细胞周期调节的TERT mRNA和端粒酶活性】作者测试了HeLa细胞，人肺成纤维细胞（HFL-1）细胞和组织标本在不同时期的TERT mRNA表达水平和端粒酶活性。不同时间的血清饥饿诱导HFL-1细胞停滞在细胞周期的不同阶段。体细胞在细胞周期的三个阶段几乎没有端粒酶的激活（图3 A-B），说明使用TERT mRNA和端粒酶活性作为肿瘤病变的早期诊断时要考虑细胞周期。接着采用PyTPA-DNA和Silole-R生物探针来检测临床患者组织样本，癌组织信号增加率为100％，卵巢囊肿信号增加率为50％（图4 AB）。CLSM图像显示，分别与PyTPA-DNA和Silole-R孵育时，两个癌组织显示出明显的红色和蓝色荧光强度（图4 C-E），进一步验证TERT mRNA和活性端粒酶在组织中的表达。Ki67和PCNA的免疫组织化学染色（IHC）验证了宫颈癌和卵巢癌的组织主要位于细胞增殖阶段（图4 F），卵巢囊肿的荧光强度远高于正常组织。而两个正常组织都几乎没有荧光。图3.（A）HeLa细胞和正常细胞在不同阶段的TERT mRNA的荧光反应I/I0。（B）HeLa细胞和正常细胞不同阶段端粒酶活性的荧光反应I/I0。图4.（A-B）不同组织标本中TERT mRNA的荧光反应I/I0和端粒酶活性。（C-E）不同组织标本中TERT mRNA表达，端粒酶活性及其相应荧光强度的图像。（F）组织样本中Ki67和PCNA的IHC染色图像。作者建立了一个高度敏感的系统，用于AIEgens在细胞周期的不同阶段对TERT mRNA的细胞表达和端粒酶活性进行成像。TERT mRNA和端粒酶活性在细胞周期中明显变化，并能够影响癌症鉴定的准确性。细胞周期进程在端粒酶激活的调节中起着重要作用。细胞周期在细胞过程中起主要作用，并具有调节各种生物标志物的能力。一些肿瘤生物标志物随着细胞周期进程而变化。因此，该AIEgens生物探针提供了在细胞周期中分化TERT mRNA和端粒酶活性的有效工具，并为开发用于细胞周期依赖性检测的探针提供了重要指导。https://doi.org/10.1093/nsr/nwaa306声明：仅代表作者个人观点，作者水平有限，如有不科学之处，请在下方留言指正！