MPB:山大倪金凤组-黄翅大白蚁肠道放线菌的分离与培养

科技工作者之家 2021-01-16

来源:宏基因组

黄翅大白蚁肠道放线菌的分离与培养

摘要:黄翅大白蚁是广泛分布于中国南部地区的一种主要培菌白蚁,为探究培菌白蚁肠道微生物的抗菌防御作用,我们对黄翅大白蚁相关放线菌展开了研究。本方案介绍从黄翅大白蚁肠道分离培养放线菌的方法。

研究背景:黄翅大白蚁作为一种培菌白蚁, 与特定真菌-鸡枞菌(Termitomyces)共生,在白蚁巢内建立菌圃,培养小白球菌Termitosphaeria duthiei(Berk.)Ciferri.)为白蚁提供营养(Hager et al., 2013;Ramadhar et al., 2014)。培菌白蚁主要分布在非洲和亚洲热带地区,在植物废弃物的降解过程中发挥重要作用(Aanen et al., 2005)。培菌白蚁自身和菌圃真菌(鸡枞菌)易受多种真菌侵染,但在健康的白蚁蚁巢中只有鸡枞菌生长,白蚁或其共生菌必然存在一定的机制来抵制致病菌,其中放线菌作为次级代谢产物主要产生者,可能起着关键的作用(徐晓 , 2018)。培菌昆虫相关放线菌是天然产物的广泛来源,结构多样的次级代谢物包括多肽、大环内酯、多烯、醌酮和生物碱等,常参与微生物-宿主的相互作用(未建华 , 2019)。昆虫肠道、体表及巢穴作为多种微生物的栖息地,蕴含着丰富的放线菌资源,本文主要介绍从培菌白蚁肠道分离放线菌的方法。

实验步骤

一、白蚁肠道放线菌的分离与纯化

1.白蚁前、中肠样品准备参照Wu文章中的方法 (Wu et al., 2012),解剖后用研磨棒充分研磨样品5-10 min,直至肠道样品呈均质状态。

2.取各个梯度PBS稀释液(101、102、103、104)150 μl分别涂布于高氏一号培养基中,30 °C培养,每天观察平板上菌落生长情况。

3.根据菌落大小和形态,在平板上挑取典型的放线菌菌落(菌落干燥紧致、明显产孢)

4.通过稀释涂布和划线的方法,经可溶性淀粉培养基纯化至只有同一种菌落,即得到纯化的克隆。

二、白蚁肠道分离菌株的序列分析

1.将纯化的菌株接入20 ml麸皮液体培养基中,30 °C培养3 d后,离心收集菌体

2.利用基因组试剂盒提取菌株的基因组DNA,用分光光度计和琼脂糖电泳法检测DNA浓度和纯度。

3.利用16S rRNA 通用引物27F 和1492R 扩增16S rRNA,PCR 体系为基因组DNA (50-200 ng/μl) 1 μl,27F1 μl,1492R 1 μl,dNTPs 4 μl,10×Buffer 5 μl, EasyTaq 1 μl,ddH2O 37 μl。PCR 条件为预变性95 °C 5 min;95 °C 30 s,58 °C 45 s,72 °C 2 min,35个PCR循环;终延伸72 °C 10 min

4.将获得的PCR产物进行琼脂糖1%凝胶电泳。

5.回收1500 bp片段,用DNA纯化试剂盒纯化PCR片段,纯化片段送上海生工测序。

6.测序结果利用NCBI Blast比对,取相似性高的序列,利用MAGE7.0 软件邻位法做系统发育树。

结果与分析

从高氏一号培养基上挑选典型的放线菌菌落,在前肠菌悬液稀释 10 倍后的平板上有比较多的具有放线菌特征的菌落。放线菌在黄翅大白蚁肠道不是优势菌,因而在较低的稀释倍数时可以得到较多的放线菌,但同一平板上细菌数目也很多,经多次稀释涂布平板和平板划线后,最后得到 13 株放线菌菌株(表1)。其中工蚁 (Worker) 前肠(Foregut) 来源的有 11 株,为 WF-1WF-2WF-3WF-4WF-5WF-6WF-7 WF-8WF-12WF-13WF-14,其相似性最高的菌株分别是 Kitasatospora cheerisanensisK. cheerisanensisStreptomyces puniceusS. coelicoflavusS. tacrolimicusK. phosalacineaS. pratensisS. luridiscabieiK. purpeofuscaK.purpeofusca S. viridobrunneus,最大相似性为 98.14%—99.93%。从工蚁中肠 ( Midgut )得到 2株放线菌: WM-1 WM-3,同 S. badiusS. fumigatiscleroticus 相似性分别为 99.79% 99.38%

表1. 基于16S rRNA 的13 株放线菌相似菌株

从 NCBI 网站分别下载 13 株菌相似菌株的 16S rRNA 序列,利用 MAGE 7.0 软件中的 Neighbor-joining 法制作进化树,比对方法为 ClustalW。从发育树(图 1)可以看出,WF-1WF-2WF-6WF-12WF-13 属于 北里孢菌属(Kitasatospora)WF-3WF-4 WF-5WF-7WF-8WF-14WM-1 WM-3 属于 链霉菌属(Streptomyces),13 株菌都属于链霉菌科 Streptomycetaceae。菌株 WF-5 与 S. tacrolimicus 似性最高,同源性为 98.14%,低于 98.65%,且系统发育树处于单独的分枝,推测菌株 WF-5是一株新的链霉菌。

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图.1 基于16S rRNA 序列的系统发育树分析(邻位法)
Figure 1. Neighbour-joining phylogenetic tree of 13 Actinomycetes based on 16S rRNA genes

注意事项

1.采集到的白蚁材料尽量在新鲜状态下立即解剖,以保证肠道放线菌的分离效果;

2.在解剖白蚁前,清洗消毒白蚁体表,以防止体外菌的污染;

3.解剖过程中先将白蚁头部去掉,按住白蚁用解剖针从尾部缓缓拉出肠道,可以保持肠道的完整性。

溶液配方

1.PBS缓冲液:NaCl 4 g,KCl 0.1 g,Na2HPO4 0.72 g,NaH2PO4 0.12 g,加蒸馏水500 ml,pH 7.4。

2.高氏一号培养基(g/L):可溶性淀粉20 g,KNO3 1 g,K2HPO4•3H2O 0.5 g,MgSO4•7H2O 0.5 g,NaCl 0.5 g,FeSO4•7 H2O 0.01 g,琼脂18 g,加蒸馏水定容至1 L。

3.可溶性淀粉培养基(g/L):可溶性淀粉10 g,K2HPO4 1 g,MgSO4 1 g,NaCl 1 g,(NH4)2SO4 2 g,CaCO3 2 g,微量盐溶液1 ml,加蒸馏水定容至1 L,pH 7.2。

4.1000×微量盐溶液(g/L):MnCl2•4 H2O 0.1 g, FeSO4•7 H2O 0.1 g, ZnSO4•7 H2O 0.1 g,加蒸馏水定容至1 L。

5.麸皮培养基(/L):100 g 麸皮加入适量水,沸水煮30 min,经纱布去除沉淀后,加蒸馏水定容至1 L。

6.LB 培养基(g/L):NaCl 10 g,胰蛋白胨10 g,酵母提取物5 g,琼脂15 g,加蒸馏水定容至1 L,液体培养基不加琼脂粉。

来源:meta-genome 宏基因组

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肠道 白蚁 放线菌

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