GPB：葛根芩连汤调节肠道菌群治疗糖尿病的关键活性成分鉴定及机制研究
以下文章来源于GPBees ，作者徐西占
基因组蛋白质组与生物信息学报
要点介绍
•研究问题：
鉴定中药复方葛根芩连汤中通过调节肠道菌群治疗2型糖尿病的关键活性成分，并阐明其可能的作用机制。
•研究方法：
本研究中，我们以自发性2型糖尿病GK大鼠为动物模型，共设置5组，包括正常Wistar大鼠组(N组)、糖尿病模型组(D组)、二甲双胍治疗组(M组)、葛根芩连汤治疗组(GQD组)和小檗碱治疗组(BBR组)，实验共干预12周。通过口服葡萄糖耐量试验(oral glucose tolerence test，OGTT)评估各组大鼠的葡萄糖代谢改善状况；利用16S rRNA基因扩增子测序评估干预前后大鼠肠道菌群的变化，并进一步检测粪便短链脂肪酸的变化；利用回肠转录组测序，比较大鼠肠道功能的改变；利用Luminex液相芯片检测大鼠的血清细胞因子水平，评估系统性炎症水平的改善情况；利用实时荧光定量PCR，检测大鼠胰岛局部炎症缓解状况。
•主要结果1：
二甲双胍、葛根芩连汤以及小檗碱治疗均可显著降低GK大鼠的血糖及胰岛素抵抗水平。
•主要结果2：
葛根芩连汤和小檗碱治疗均可显著改变GK大鼠的肠道菌群结构，促进其向正常菌群结构恢复，显著富集包括Faecalibacterium、Roseburia和Gemmiger等菌属在内的多种产丁酸细菌，增加乙酸、丙酸和丁酸等短链脂肪酸含量。
•主要结果3：
葛根芩连汤和小檗碱治疗可显著下调回肠免疫相关基因的表达，并上调糖脂代谢相关基因表达，从而调控GK大鼠的肠道黏膜免疫，提高脂质和碳水化合物的代谢能力。
•主要结果4：
糖尿病GK大鼠的系统性炎症水平及胰岛局部炎症水平在药物治疗后显著降低。
背景介绍
糖尿病是一种由遗传因素、表观遗传修饰和环境因素等多种致病因子共同作用所引起的以血糖升高为特征，同时伴有系统性低水平炎症、胰岛素分泌不足或功能障碍的慢性代谢性疾病，从而导致糖、脂肪、蛋白质、水和电解质等代谢紊乱，影响机体的正常生理活动。近年来，随着人们生活水平的提高和生活方式的改变，2型糖尿病的发病率逐年升高，已成为严重危害人民健康的重大公共卫生问题。
大量研究表明，肠道菌群失调在2型糖尿病的发生发展过程中发挥着关键的作用，会导致有益菌(如Faecalibacterium、Bifidobacterium)的减少以及有害细菌(如Desulfovibrio)的异常繁殖，从而诱发机体的慢性低水平炎症，造成胰岛素抵抗，引起人体的糖脂代谢异常。因此，以肠道菌群为靶点，采用生活方式干预(如饮食、运动等)、补充微生态制剂(益生菌、益生元和合生元等)、降糖药物、菌群移植等手段，对肠道菌群进行靶向性调节成为防治2型糖尿病的新策略。而降糖药物调节肠道菌群的研究最引人注目，特别是对一线降糖药物二甲双胍的研究最为透彻。二甲双胍可以调节肠道菌群，富集产短链脂肪酸细菌，增加短链脂肪酸水平。一方面短链脂肪酸可以刺激肠道内分泌L细胞分泌胰高血糖素样肽-1和酪酪肽，改善糖脂代谢；另一方面富集的益生菌可以降低肠道通透性，减少脂多糖的含量，从而减轻机体低水平炎症，提高胰岛素敏感性。
中药在调节肠道菌群中也发挥着重要作用。我们的前期研究发现，中药复方葛根芩连汤可通过调节肠道菌群，富集Faecalibacterium、Gemmiger和Blautia等产丁酸细菌而治疗2型糖尿病。然而，由于中药复方化学组成分复杂(例如，葛根芩连汤由黄连、黄芩和葛根等多种草药组成，含量较高的活性成分包括小檗碱、黄芩苷和葛根素等)，严重限制了其广泛应用，因而确定该复方中的主要活性成分并阐明其作用机制对于葛根芩连汤的临床应用具有重要的指导意义。巧合的是，二甲双胍的发现便是源于人们对草药山羊豆和山羊豆碱的长期研究探索。
小檗碱，属于生物碱类物质，口服吸收差，可通过富集产短链脂肪酸的细菌，发挥降糖效果。经过大量的文献调研，我们推测小檗碱可能是葛根芩连汤在治疗2型糖尿病时与肠道菌群互作的关键活性成分。基于此，本研究以GK大鼠为动物模型，通过比较葛根芩连汤和小檗碱在疗效、调节肠道菌群、诱导回肠基因表达谱改变以及改善宿主炎症状态等方面的差异，旨在确认小檗碱是否可作为葛根芩连汤中通过调节肠道菌群治疗2型糖尿病的关键活性成分，以期为阐明中药复方调节肠道菌群的作用机制提供新的研究方法与策略。
主要结果
药物治疗可改善糖尿病GK大鼠代谢状况
为了探索不同治疗方法对大鼠的影响，我们监测和分析了治疗12周期间各组大鼠血糖和体重的变化。由给药期间大鼠体重的动态变化曲线可知，GK大鼠(D组、M组、GQD组和BBR组)的体重在实验期间的每个时间点均显著低于正常Wistar大鼠组(N组)(P < 0.05)。与糖尿病模型组(D组)相比，其他三个药物干预组(包括M组、GQD组和BBR组)的大鼠体重无显著性差异(P > 0.05)(图1A)。血糖变化方面，与N组相比，所有GK大鼠组的随机血糖水平均明显较高。与D组相比，药物治疗组血糖水平明显降低(图1B)。
OGTT试验发现，三个药物治疗组的大鼠峰值血糖糖水平均显著低于糖尿病模型组，且在峰值过后，血糖水平下降较为迅速(图1C)。此外，与糖尿病模型组相比，药物治疗组的血糖曲线下面积均显著降低(P < 0.01)，M组、GQD组和BBR组分别减少了30.3%、22.3%和19.2%(图1D)，表明药物治疗显著提高了GK大鼠的葡萄糖代谢能力。同时，三个药物干预组的空腹血浆胰岛素水平(图1E)以及胰岛素抵抗指数(图1F)也显著降低，表明GK大鼠的胰岛素抵抗状况明显改善。
图1 不同药物治疗对大鼠代谢的影响
药物干预显著改变大鼠肠道菌群结构
图2 药物干预前后大鼠肠道菌群的改变
葛根芩连汤和小檗碱治疗
显著增加粪便短链脂肪酸水平
为进一步确认富集的菌属是否确实增加了丁酸的含量，我们接下来测量了各组大鼠粪便中短链脂肪酸(包括乙酸、丙酸和丁酸)的浓度。结果表明，GQD和BBR治疗后，两组大鼠粪便中的乙酸、丙酸和丁酸含量均得到显著增加(P < 0.05)，而M组的短链脂肪酸水平在干预前后均未发生显著变化(图3A−C)。此外，药物干预后，GQD组的乙酸水平显著高于其他四组(P < 0.05)，而丁酸水平与N组的含量相当，显著高于D组、M组和BBR组(P < 0.05)。以上结果表明，GQD和BBR治疗后大鼠粪便中短链脂肪酸水平显著升高，这和两种药物能显著富集产丁酸菌属的结果相一致。
接着，我们对各组大鼠粪便中短链脂肪酸的水平与肠道菌群的菌属相对丰度之间的相关性进行了分析，并采用热图对Spearman相关系数进行可视化展示。从总体上看，粪便短链脂肪酸水平，尤其是丁酸，与上述GQD和BBR组富集的多个产丁酸菌属的相对丰度呈正相关，而与一些丰度降低的潜在致病菌属的相对丰度呈负相关，例如Helicobacter(图3D)。这些结果表明，短链脂肪酸的含量与相应实验组肠道微生物组成变化高度一致，提示GQD和BBR治疗显著富集的菌属增加了短链脂肪酸的含量。
图3 大鼠粪便短链脂肪酸含量在药物干预前后的
变化
葛根芩连汤和小檗碱治疗改变了回肠基因表达谱
先前研究表明，肠道菌群可以调节胃肠道上皮细胞中的基因表达。GQD和BBR治疗后，GK大鼠肠道菌群发生了显著改变，因此我们进一步通过比较转录组学分析来确定不同处理组之间大鼠回肠基因表达谱的差异。首先，我们将4组GK大鼠间两两比较获得的855个差异表达基因(DEGs)根据其在4组中的基因表达模式进行聚类分析，得到4个Cluster(图4A)。
接着，我们将分属4个不同Cluster的DEGs分别进行GO富集分析(图4B)，发现Cluster 1的DEGs主要富集许多与免疫激活相关的GO terms，例如“T cell activation”(Cd3d、Cd3e、Cd8a、Fyn、Lck、Zap70和Cd28等基因)，而Cluster 2富集的GO terms与细胞因子产生和分泌有关(Ccr5、Irf4、Il17a、Tlr8、Foxp3和Il17f等基因)。有趣的是，我们发现Cluster 1和Cluster 2中的DEGs主要由GQD和BBR组中显著下调的基因组成，这暗示了GQD和BBR治疗在减轻肠道炎症中的潜在作用。Cluster 3中的DEGs富集一些与脂质和碳水化合物代谢有关的GO terms，例如“fatty acidmetabolic process”(Apoa1、Apoa4、Apoa5、Apoc3、Angptl4、Cyp2b1、Cyp2d2、Cyp2d3、Cyp2d5、Cyp4a1、Slc27a2和Adh7等基因)和“carbohydrate transport”(Slc2a2、Slc2a5、Slc2a7、Slc5a1、Slc5a4、Slc5a9、Aqp1、Aqp7和Lct等基因)。Cluster 4也富集了一些脂质代谢相关的GO terms，例如“long-chain fattyacid metabolic process”(Cyp2b2、Cyp2c23、Cyp2c6v1、Cyp2j4、Cyp4f18、Cd36和Pnpla3等基因)。鉴于Cluster 3和4中的DEGs在GQD组和BBR组中均显示了相对较高的表达量，这些结果表明GQD和BBR处理后GK大鼠的脂质和碳水化合物的代谢能力显著改善。
此外，我们对4个GK大鼠实验组间两两比较(M vs. D; GQD vs. D; BBR vs. D; GQD vs. M; BBR vs. M; BBR vs. GQD)的DEGs进行GO富集分析(图4C)。GQD和BBR治疗均显著下调了免疫反应相关的GO terms，并上调了对金属离子的反应、药物及长链脂肪酸代谢过程等GO terms，这和上述基因表达模式聚类的富集结果一致。此外，通过这4组之间的比较转录组学分析，我们观察到GQD和BBR治疗对GK大鼠具有相似的GO term富集图谱，而在M vs. D和BBR vs. GQD比较中，均只有很少的GO terms被富集，这表明二甲双胍治疗对宿主的影响弱于GQD和BBR。同时，GQD和BBR组间的DEGs仅富集5个GO terms，并且完全由上调的DEGs富集，包括“purine nucleoside monophosphate biosynthetic process”、“GMP metabolic process”、“hydrogen ion transmembrane transport”和“cellular metabolic compound salvage”等。
进一步，我们将3个治疗组与D组的DEGs通过韦恩图分析鉴定各组共有或特有的基因列表(图4D)。GQD和BBR组中有169个共有的DEGs，几乎占两组DEGs数目的一半 [GQD：49.3% (169/343)；BBR：50.1% (169/337)]。有趣的是，除基因Unc93a外，其他168个共有的DEGs均显示出一致的基因表达趋势(与D组相比，其表达量显著下调或上调)，表明GQD和BBR对GK大鼠回肠转录组的影响极其相似，这也与前述大鼠的表型数据、肠道菌群差异等结果相一致。这169个共有的DEGs主要富集许多免疫相关和少量糖代谢相关的GO terms，并对2个代表性显著富集的GO terms，即“positive regulationof immune response”(GO:0050778)和“carbohydratetransport”(GO:0008643，用红星表示)中DEGs的表达谱进行展示，发现属于调节免疫应答的GO terms的基因表达量显著下调，而参与碳水化合物转运的基因表达量则显著上调，表明GQD和BBR治疗可通过相似的机制缓解糖尿病，即减轻炎症并改善大鼠糖代谢能力。
综上所述，回肠转录组数据表明，GQD和BBR治疗可以显著减轻GK大鼠回肠的炎症，并可能通过改变肠道菌群来改善脂质和碳水化合物的代谢。
图4 不同大鼠处理组间回肠转录组学的比较
药物治疗显著降低GK大鼠的系统性炎症与
局部炎症水平
为了进一步验证大鼠的系统性炎症水平是否得到缓解，我们对血清中6种促炎细胞因子的含量进行了检测。结果发现，与D组相比，3个药物干预组(M、GQD和BBR组)中6种促炎细胞因子IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α、IFN-γ和MCP-1的含量均显著降低(P < 0.01)，表明经药物治疗后，糖尿病GK大鼠的系统性炎症水平得到显著降低(图5)。
图5 药物治疗对大鼠血清促炎细胞因子的影响
此外，我们还通过荧光定量PCR技术检测胰岛中关键免疫相关基因的表达水平，以探究不同治疗方法对大鼠胰岛炎症水平的影响。结果发现，治疗12周后，参与胰岛β细胞炎症过程的三个代表性基因(Nfkb1、Stat1和Ifngr1)的表达水平经3种不同药物治疗后均显著下调(P < 0.01)。此外，与M组相比，GQD和BBR组Nfkb1和Stat1的表达水平相对较低，而Ifngr1的表达水平相似(图6)。以上结果表明，二甲双胍、GQD和BBR治疗可以缓解胰岛细胞的局部炎症状态。
图6 胰岛β细胞中免疫相关基因表达水平的改变
总结与展望
本研究综合运用多组学技术，系统探究了中药复方葛根芩连汤以及活性成分小檗碱通过靶向肠道菌群缓解2型糖尿病的机制，即通过富集产丁酸细菌，调控肠道黏膜免疫和糖脂代谢等功能，从而减轻系统性和胰岛局部炎症水平，改善胰岛素抵抗。我们的研究为探究中药与肠道菌群的相互作用机制提供了很好的研究案例，并增进了对小檗碱这一有望用于治疗2型糖尿病的新药作用机制的理解。
文章编译来源：Xizhan Xu, Zezheng Gao, Fuquan Yang, Yingying Yang, Liang Chen, Lin Han, et al. Antidiabetic Effects of Gegen Qinlian Decoction via the Gut Microbiota Are Attributable to Its Key Ingredient Berberine. Genomics Proteomics Bioinformatics 2020;18(6). https://doi.org/10.1016/j.gpb.2019.09.007. 引用请参考以上格式，英文全文详见
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1672022920301431
中国科学院微生物研究所王军研究员，中国中医科学院广安门医院仝小林院士和赵林华研究员为该文的共同通讯作者。中国科学院微生物研究所徐西占博士、中国中医科学院广安门医院高泽正博士为该文的共同第一作者。该研究得到了中国科学院战略性先导科技专项、国家自然科学基金、中国科学院重点部署项目等多项资金的资助。更多信息可访问：http://www.im.cas.cn/jgsz2018/yjtx/zgkxybywswymyxzdsys/201811/t20181109_5168628.html；http://www.gamhospital.ac.cn/gzb/department/endocrine_department/doctor/3353.html；
http://www.gamhospital.ac.cn/gzb/department/endocrine_department/doctor/3453.html
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Genomics, Proteomics & Bioinformatics（基因组蛋白质组与生物信息学报，简称GPB）于2003年创刊，是由中国科学院主管、中国科学院北京基因组研究所（国家生物信息中心）与中国遗传学会共同主办的英文学术期刊，由Elsevier金色开放获取（Gold Open Access）出版。刊载来自世界范围内组学、生物信息学及相关领域的优质稿件。现为中国科学引文数据库（CSCD）和中国科技论文与引文数据库（CSTPCD）核心期刊，被SCIE、PubMed / MEDLINE、Scopus等数据库收录。2018、2019、2020连续位于中科院文献情报中心期刊分区表大类“生物1区Top"。2019年，CiteScore为10.9，位于“计算数学”、“遗传学”、“生物化学”、“分子生物学”四个学科领域Q1区；Impact Factor为7.051，位于“遗传学与遗传性”学科领域前10%。期刊由科技部等七部门联合实施的“中国科技期刊卓越行动计划”资助（2019–2023）。