专家介绍:于丽芳
华东师范大学化学与分子工程学院研究员。2009 年博士毕业于中国科学院上海药物研究所,2009—2013 年在美国伊利诺伊大学芝加哥分校从事博士后研究,2013 年 7 月加入华东师大上海市分子治疗与新药创制工程技术研究中心汤杰教授团队,目前担任课题组长。主要研究方向为药物化学及相关化学生物学,聚焦于药物先导化合物的结构创新。采用“基于天然产物优势结构”的先导化合物发现策略,针对临床需求选取耐药结核病和神经系统等疾病亟需解决治疗难题开展药物化学工作,取得的特色成果有:发展了靶向 Pks13 的抗结核天然产物衍生物,具有镇痛作用的烷氧基异 唑类 s1 受体配体,以及治疗多发性硬化症的大麻素受体激动剂等多个体内有效的创新性药物先导化合物。作为项目负责人承担省部级以上项目 6 项,包括 2 项国家自然科学基金和 1 项国家科技重大专项子课题任务。在包括药物化学领域的 J Med Chem 等国际期刊上发表 SCI 学术论文 30 多篇,参写英文学术专著 1 部,申请国内发明专利 15 项。此外,还担任药物化学、化学生物学、天然产物化学等领域国际权威 SCI 学术期刊特约审稿人。2018 年获得第二十一届中国药学会-施维雅青年药物化学奖,同年被评为紫江青年研究员。
正文
具有偏向性的大麻素受体配体研究进展
裴方宁,杨帆,汤杰,于丽芳 *
(华东师范大学化学与分子工程学院,上海分子治疗与新药创制工程技术研究中心,上海 200062)
[摘要] 大麻素受体是多种疾病的潜在治疗靶标,属于 G 蛋白偶联受体(GPCR)的 A 家族,主要包括大麻素Ⅰ型受体(CB1)和大麻素Ⅱ型受体(CB2),分布在体内不同部位。现有研究多集中于 2 种亚型受体的选择性而非具体信号通路的选择性,但已有研究显示信号通路的选择性与成瘾性密切相关。受体激活后,CB1 和CB2与下游每个信号传导途径的作用程度不同,该现象称为偏向性激动。GPCR 与配体结合时的构象是多样化的,偏向性激动剂选择性地稳定一组受体构象,特定地激活下游信号传导途径,从而降低不良反应。综述大麻素受体的结构特征、偏向性信号以及偏向性配体的研究进展,以期为相关研究提供参考。
G 蛋白偶联受体(GPCR)属于膜蛋白家族,它由穿过质膜的 7 个 α-螺旋构成,膜内为 C 端,膜外为 N 端。目前,靶向 GPCR 药物的销售额约占全球药物市场份额的 27%。大麻素受体属于 GPCR 的A 家族,主要包括大麻素Ⅰ型受体(CB1)和大麻素Ⅱ型受体(CB2)2 个亚型,此外,还有 GPR18、GPR19 和 GPR55 等。GPCR 配体包括内源性配体 anandamide(AEA)、N-花生四烯酸-多巴胺(NADA)和 2-花生四烯酰甘油(2-AG)等,另外有植源性配体 19-四氢大麻酚(THC)以及合成大麻素配体。目前,大麻素受体及配体存在偏向性逐渐被发现并认识,其重要性也逐渐体现。
1 大麻素受体主要亚型
CB1由472个氨基酸组成,主要存在于海马体、皮质、基底神经节和小脑中,是中枢神经系统中最丰富的一种 GPCR。CB1 激动剂具有治疗疼痛、炎症以及神经退行性疾病等疾病的潜在价值,CB1 拮抗剂可用于治疗肥胖以及肝纤维化等。利莫那班(rimonabant)是首个应用于临床的 CB1 拮抗剂,2006 年作为新型减肥药在欧盟上市,但因其存在致抑郁、焦虑甚至自杀等精神方面的严重不良反应,2008 年被撤市。因此,目前研究多限于外周限制性CB1 拮抗剂。CB2 由 360 个氨基酸构成,与 CB1 的氨基酸序列存在 44% 同源性,跨膜区高达 68% 。
CB2主要存在于外周神经系统的免疫器官、组织及细胞中,在神经元中表达水平较低。CB2 受体与多发性硬化、阿尔茨海默病和肝纤维化等疾病的炎症过程有关。此外,CB2 受体还参与缓解疼痛、防止骨质流失等生理学过程。
在 CB1 拮抗剂-受体复合物晶体结构中,拮抗剂以类似 T 形的形态结合到口袋中,CB1 受体的 N 末端在配体识别中起关键作用:N 末端的非截短部分形成 V 形环,插入配体结合口袋中,充当塞子以限制小分子化合物从细胞外侧进入口袋。同时,第 2 个细胞外环折叠成复杂结构,使氨基酸残基 268 ~ 271 突出到结合口袋中,这 4 种氨基酸残基对配体与受体的相互作用至关重要。此外,半胱氨酸 Cys257、Cys264 与 CB1 的功能关系密切,这可能与二硫键稳定了受体的构象使得配体可识别有关(见图 1)。
CB1 激动剂以 L 形结合到口袋中,相较于拮抗剂,其结构发生显著重排:螺旋Ⅰ向内弯曲 6.6 Å,螺旋Ⅱ旋转约 6.8 Å,螺旋Ⅵ向外移动约 8Å,导致结合口袋体积减少 53%。该结构重排与 Phe2003.36和 Trp3566.48 协同构象改变关系密切,被称为“双拨动开关”。在 CB1 拮抗剂的结合口袋中,Phe2003.36指向远离配体结合口袋方向,并与 Trp3566.48 形成 π-π堆积相互作用;而在 CB1 激动剂的结合口袋中,螺旋Ⅲ的协同旋转和 Phe2003.36 的侧链翻转可使苯环指向配体,同时,螺旋Ⅵ的向外旋转致 Trp3566.48 的侧链偏离配体,破坏了 Phe2003.36 和 Trp3566.48 的 π-π堆积相互作用,因此该“双拨动开关”可能与 CB1受体激活相关(见图 2)。
CB2 拮抗剂的结合情况整体上与 CB1 拮抗剂不同,与其中关键残基 Trp6.48 构象也不同。CB2 拮抗剂将 Trp2586.48 的侧链限制在一种相对稀有的旋转异构体中,受限的 Trp2586.48 构象可能会限制螺旋Ⅵ的向外移动;CB1 拮抗剂将螺旋Ⅰ和螺旋Ⅱ向外推,使 Phe2003.36 限制 Trp3566.48 的移动。与 CB1激动剂相似,CB2 拮抗剂也以 L 形结合到口袋中,两者细胞外部分相似,并且关键氨基酸残基几乎相同,均包括:Phe183ECL2、Phe872.57、Val1133.32、Phe1173.36、Trp2586.48、Thr1143.33、Ile186ECL2、Trp1945.43、Ser1654.57、Phe912.61、Phe942.64和His952.65(见图 3)。
2 大麻素受体信号通路
GPCR 负责将细胞外信号传导至细胞质,它被特定配体激活后,与异源三聚体 G 蛋白结合并水解三磷酸鸟苷,从而介导下游信号传导。G 蛋白由Gα、Gβ 和 Gγ 3 个亚基组成。Gα 亚基可进一步被分 为 4 个 亚 组:Gαs、Gαi/o、Gαq/11 和 Gα12/13。Gα亚基可单独传导信号,而 Gβ 和 Gγ 亚基必须结合形成 Gβγ 才可以传导信号。GPCR 偶联 G 蛋白后,受体活化调节关键效应物肌醇 1,4,5-三磷酸(IP3)、腺苷酸环化酶(AC)等介导第二信使 Ca2+、环磷酸腺苷(cAMP)等的产生。Gβγ 亚基可以作为离子通道调节剂或受体激酶等调节信号传导。
GPCR 不仅受 G 蛋白调控,还受支架蛋白的调控,受支架蛋白调控的信号通路被称为非 G 蛋白依赖的信号传导途径,其中研究较为充分的是β-arrestin依赖性信号传导途径。GPCR 活化后可释放、激活相关 G 蛋白,G 蛋白偶联受体激酶(GRK)磷酸化 GPCR 细胞内的结构域,磷酸化的 GPCR 募集β-arrestin,使得 GPCR 内化和信号传导脱敏,导致传导信号的“关闭”,从而产生 G 蛋白依赖性信号传导的负反馈。
大麻素受体主要通过抑制 Gαi/o 传导信号来抑制AC 活性,从而导致 cAMP 水平降低(见图 4),还可以与 β-arrestin 作用来调控细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)的产生。在某些情况下,CB1 能够与 Gαs 偶联,从而刺激 cAMP 产生,与 Gαq 共同调节 Ca2+ 的产生,目前尚不清楚 CB2 是否可以与其他 G 蛋白结合,大麻素受体信号通路与靶标作用的关系也不明确。有研究表明,大麻素受体配体若偏向于 Gαi/o 信号传导通路,有利于细胞存活,保持亨廷顿蛋白突变细胞的功能,这一原理可用来治疗亨廷顿病(HD);若激活 Gαi/o 信号传导通路,降低 β-arrestin 作用,可以产生镇痛作用同时降低药物成瘾性。
3 偏向性信号传导
长期以来人们一直认为 GPCR 与 G 蛋白或β-arrestin 偶联后可并行或有序地触发多种细胞内信号传导。直到 1995 年,Kenakin首次提出了GPCR 偏向信号传导的概念。同一配体对各种细胞反应可显示出不同的功效,称为功能选择性或偏向性。“功能选择性”是较早的术语,仅表示一种或多种功能的功效差异,而“偏向性”是对不同通路(例如 G 蛋白与 β-arrestin)定量的分析。偏向性信号不仅存在于 G 蛋白和 β-arrestin 之间,也存在于 G 蛋白不同亚型之间。目前,偏向性信号传导的具体分子机制尚不清楚,被业内普遍接受的是受体磷酸化的“条形码(BarCode)”假说。该假说认为,偏向性配体能够诱导一种独特的受体构象,然后通过效应子(如 G 蛋白或 β-arrestin)来激活特定的信号传导途径。例如,在第二信使蛋白 Gαs 存在下,β2 肾上腺素受体与其激动剂的构象已被证实较为独特,TM6 的胞内末端向外移动了 2.1 Å,保守脯氨酸残基向外移动了 1.4 Å。受体构象的差别导致细胞内 GRK 对受体磷酸化行为的改变,进而调控 β-arrestin 的招募。GRK2/3 和 GRK5/6 通过对不同 C 末端区域磷酸化来发挥条形码作用。GRK5/6磷酸化受体被认为是 β-arrestin 信号通路偏向性的标签;而 GRK2/3 磷酸化受体被认为是 G 蛋白信号通路偏向性的标签。典型 GPCR 如血管紧张素 I型受体(At1R)的偏向性信号研究发现,无配体结合的 At1R 本身就存在构象集合,大多数氨基酸残基对之间存在 2 种不同的距离,而不是单一的非激活态;与无配体结合相比,At1R 与反向激动剂结合后,ICL2-TM6 和 TM5-Helix8 之间的距离变化较大;At1R 与激动剂结合后的变化更明显,TM1-TM6 之间的距离从 31 ~ 34 Å 变为 42 Å 左右,ICL2-TM7 之间的距离变短,与此同时 TM7 发生内倾;受体不仅在拮抗和激动时构象不同,激动不同信号通路时构象也存在差异,β-arrestin 偏向性激动的受体构象中TM7 内移,ICL2 大幅内移,TM5 小幅外移,TM6大幅外移,该构象特点会阻碍其与 G 蛋白偏向性配体的结合;G 蛋白偏向性激动的构象特点为 TM7 内移,TM6 外移,TM5 大幅向 TM6 移动,ICL2 基本不移动,这使得其有利于和 G 蛋白偏向性配体相结合。该研究为偏向性信号传导机制及其他 GPCR作用机制研究提供了新的思路。
目 前, 对 GPCR 偏向性配体的研究已经取得了重要进展,其中,μ-阿片受体的偏向性配体oliceridine 正 处 于 临 床 研 究 阶 段。Oliceridine 可 以选择性地激活 G 蛋白通路,从而发挥镇痛作用,而不与 β-arrestin 通路作用,从而减轻甚至避免阿片类药物产生的便秘、呼吸抑制和成瘾性等不良反应。在抗精神病药物中也发现了偏向性配体降低不良反应的情况, 如 aripiprazole、UNC9975 和UNC9994 可选择性激动 β-arrestin 信号通路,改善NR1 基因敲除的低谷氨酸能小鼠的精神分裂症的相关症状,同时减少了与 Gαi 偶联相关的多巴胺依赖性过度运动等不良反应。由于偏向性配体可能具有巨大的治疗优势,所以具有偏向性激活大麻素受体的药物值得大力开发。目前,对于大麻素受体偏向性的研究还处于基础阶段,首个大麻素受体偏向信号传导的证据来自 Glass 等研究,该研究证实了 CB1 激动剂 AEA 和 WIN-55212-2 对 Gαi 激活作用比对 Gαo 强。短期使用 CB1 激动剂会产生不良的精神作用,长期服用会产生依赖性,吲哚奎尼丁酮类似物 PNR-4-20 和 PNR-4-02 是高度偏向 G 蛋白信号通路的激动剂,与无偏向性 CB1 激动剂相比,其降低了药物依赖性,减少了不良反应。
量化偏向性需要同时考虑效力和最大响应,目前最常用的一种是用转导系数来衡量,即通过量化药物反应的 Black-Leff 模型计算转导系数 τ/KA(其中 τ:包含激动剂效力、受体密度和系统内的偶联;KA:解离常数,在功能测试中为亲和力的倒数)。另外,还可以用相对活性(log RA)衡量偏向性,log RA=log(max/EC50)(其中 max 为最大响应值;EC50 为激动剂效力)。另外,还有比较完全激动剂和部分激动剂活性相同时的药物浓度(τ/KA)来衡量量化偏向性,此方法与相对活性一样,仅适用于浓度-响应曲线斜率无显著差异的系统。
4 偏向性大麻素受体配体
4.1 CB1 配体偏向性
既往研究已经证实了几种大麻素受体配体对CB1 的作用存在偏向性,其不能均等地激活相关 G蛋白和 β-arrestin 通路,因此显示出下游信号传导途径的偏向性。目前,对于 CB1 相关疾病的研究很多,但关于配体偏向性与其功能之间的具体联系研究较少。笔者就此总结了代表性CB1偏向性配体(内源性、植源性、大麻类似物、氨基吲哚类和二苯基类大麻素配体)及其功能(见表 1)。
4.1.1 G 蛋白和 β-arrestin 通路间偏向性 以 WIN55212(化合物 1)作为对照化合物,内源性大麻素配体 2-AG(化合物 2)和 AEA(化合物 3)相对于 β-arrestin1 通路均优先选择 Gαi/o 通路并且改善HD 细胞的活力;与其相反的是,植源性大麻素配体 THC(化合物 4)和大麻素类似物 CP55940(化合物 5)偏向于 β-arrestin1 通路并且降低 HD 细胞的活力。配体偏向性和细胞活力之间的关系研究表明,增强 Gαi/o 信号传导可能对 HD 治疗有益;而偏向 β-arrestin1 的大麻素配体可能对 HD 治疗不利。其他合成类大麻素配体的偏向性也各有不同,例如 HU-210(化合物 6)优先激活 Gαi/o 信号,经过结构改造所得的 PNR-4-02(化合物 7)和 PNR-4-20(化合物 8)偏向于 Gα 信号通路并且对 β-arrestin信号通路作用减弱;ORG27569(化合物 9)偏向性激活 β-arrestin2 信号通路,结构优化得到的PSNCBAM1(化合物 10)则优先与 β-arrestin1 发生作用。
4.1.2 G 蛋白不同亚型之间偏向性 偏向性不仅存在于G蛋白与β-arrestin之间,在G蛋白之间也存在偏向性。如 2-AG(化合物 2)对 Gαi 作用强度大于 Gαq/11;AEA(化合物 3)则对 Gαi 作用强度大于 Gαs;THC(化合物 4)对 Gαi 和 Gαs 作用强度相当;CP55940(化合物 5)对不同亚型的 G 蛋白选择性存在差异,呈以下顺序 Gαs>Gαi>Gαq/11;HU-210(化合物 6)偏向于 Gαi/o,与 Gαq 偶联较弱;NADA(化合物 11)几乎只作用于 Gαq 信号通路以调节 Ca2+,不与 Gαi/o/s作用;WIN-55212-2(化合物 12)对 Gαi 和 Gαs 作用强度相当,均优先于 Gαo。因此,目前绝大部分研究集中于 G 蛋白与 β-arrestin 之间的偏向性,而针对G 蛋白不同亚组之间的偏向性研究较少,化合物结构特征与 G 蛋白亚组偏向性之间无明显对应关系。
4.2 CB2 配体偏向性
CB2 的配体偏向性是由 Shoemaker 等首次发现。CB2 主要与 Gα 蛋白偶联,CB2 是否可以与其他G 蛋白结合尚不清楚。所以,对于 CB2 受体的研究主要是 G 蛋白和 β-arrestin 通路之间的偏向性。CP55940(化合物 5)在两者间不存在明显的偏向性,以它作为对照化合物,AEA(化合物 3)没有显示出偏向性;而 HU910(化合物 13)、HU308(化合物 14)在人和小鼠的 CB2 呈现出不同的信号传导偏向性,它们在人 CB2(hCB2)的信号转导途径表现为无偏向的平衡的激动剂,但在小鼠 CB2(mCB2)上相对于 β-arrestin 通路,明显偏向于 G 蛋白信号通路。因此,在测试配体时,需要考虑到种属间差异。2-AG(化合物 2)、THC(化合物 4)、WIN55212-2(化合物 12)、JWH-133(化合物 15)和 JWH015(化合物 16)表现为 G 蛋白偏向性,而 MH(化合物 17)、AM1710(化合物 18)、AM1248(化合物 19)、STS-135(化合物 20)和AM1241(化合物 21)显示出 β-arrestin 偏向性质。LY2828360(化合物22)是G蛋白偏向性CB2激动剂,可减轻化疗药物诱发的神经性疼痛,而不会产生耐受性,并可以延长阿片类药物的镇痛作用时间,同时降低阿片类药物的依赖性。因此,对于每个结构类型,如植源性大麻素和大麻类似物或氨基吲哚类,它们结构差异不大,但有时偏向性质却相反;或者结构发生微小的变化,其偏向性往往就会发生较大变化,这也使得对于偏向性配体的构效关系的研究变得困难(见表 2)。此外,CB2 配体有抗炎、镇痛等作用,相关研究也比较多,但有关偏向性配体对其功能的影响研究极少。
5 结语
综上所述,大麻素受体是疼痛、肥胖、炎症以及精神疾病的靶标,是一个非常有吸引力的研究领域。“偏向性配体”概念的提出为 GPCR 信号传导研究以及靶向性药物研发带来了更多方向。目前,已有证据表明配体偏向性与不良反应密切相关,例如对血管紧张素Ⅰ型受体、阿片受体等具有偏向性的配体明显降低了药物不良反应,偏向性 CB2 受体配体 LY2828360 发挥镇痛作用的同时可减少药物依赖性等,因此偏向性配体值得进一步研究。大麻素受体 CB1 和 CB2 作为 GPCR 家族的一员,其偏向性作用的研究尚处于初期阶段,但由于其是多效应偶联的 GPCR,可介导多种生理反应,所以被广泛认为是研究偏向性信号传导的理想模型。因此,鉴定和表征具有偏向性的配体对进一步阐明大麻素受体偏向性激动和细胞内受体信号传导的机制具有重要价值。由于 CB1 和 CB2 氨基酸整体序列的同源性为44%,跨膜区序列同源性高达 68%,同时,两者结合口袋关键残基高度一致,使得发展偏向性大麻素受体配体具有较高挑战性,而发展专一信号通路大麻素受体配体有利于研究信号传导机制,也有利于研究不良反应与具体信号通路的相关性,从而研发出低不良反应的大麻素配体。
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