对话诺奖得主Joachim Frank，探索冷冻电镜的重构艺术

冷冻电镜诞生发展的历程

提到冷冻电镜的诞生历程，故事还得从一个动物细胞讲起。基于还原论（Reductionism，在生物学领域可理解为将生命过程还原为分子运动规律、物理-化学过程），要理解生命，则要更进一步到达分子的层面。1998年Bruce Alberts提出了“分子机器”（molecular machine）概念：细胞内分子并非散乱碰撞，而是通过组装井然有序地行使功能。ATP合成酶、蛋白酶体、分子伴侣、剪接体，以及Frank教授实验室的主要研究对象——核糖体等，都是分子机器。我们既希望了解分子机器的组分结构，也希望知道组分间动态互作的方式。

在冷冻电镜技术诞生前的1968年，Frank教授当时还是一名研究生，Walter Hoppe和Max Perutz组织了一次X-ray crystallography 和EM of proteins领域的交流会，席间有Richard Henderson、Hugh Huxley、Nigel Unwin等诸多彼时学术届的名人出席。由此可见，为解析更多生物大分子的组分与结构，此时X射线晶体学和蛋白电子显微技术领域的交流已经十分频繁了。

X射线晶体学是解析生物大分子结构的老牌手段，但其弊端在于无法观测分子的多种构象或结合状态、样品量需求大，最大的问题是许多分子并不形成规律晶体。电子显微镜技术也可用于解析分子结构，但要求样品极薄，且高能电子会损伤分子结构，最终得到的二维图像是分子的投影。

那么，是否可以利用二维投影获得三维重构呢？在1968年至1975年间，出现了三篇开创性的工作：1968年，剑桥MRC实验室的Aaron Klug和De Rosier获得了T4噬菌体尾部的三维结构；1971年，Tony Crowther获得了番茄丛矮病毒的三维结构；1975年，Richard Henderson和Nigel Unwin获得了细菌紫红质的三维结构。但前两项工作均利用了分子的特殊对称性，后一项工作只能适用于少数能够生长为二维晶体的分子，其方法均不具有普适性。

Frank教授当时的导师Walter Hoppe认为，三维重构并不一定要求分子具有特殊对称性或生长为晶体，对于没有对称性的分子，也可以通过拍摄多角度的电子显微照片，获取多个角度的投影进行三维重构，即电子断层扫描技术。但Frank通过计算发现，这种方法累积的电子剂量将对分子造成严重的辐照损伤，使得重构毫无意义。经过进一步思考，Frank进而提出了单颗粒三维重构的概念：经过提纯后的分子在溶液中有很多拷贝，它们可能包含各种自然构象，其空间取向也是随机的，一张图像即可囊括该分子很多空间取向；当我们获取足够多的图像之后，就可以获得该分子所有方向的投影以完成三维重构。在提出这一方法之后，Frank又与Saxon合作，在理论上证明了这一方法的可行性，但阻碍课题进展的还有很多技术性难题。Frank领导开发了第一个单颗粒三维重构的软件包SPIDER，并不断纳入新的计算工具，以攻克这些技术难题。

有了好的计算工具，还需要有好的测试样品。在1980年一次关于单颗粒技术的讲座中，一位名为Miloslav Boublik的参会者向Frank教授展示了其拍摄到的Hela细胞核糖体清晰的电子显微图像。核糖体具有相对稳定的构象和适当的大小， Frank教授意识到这正是最佳的测试样品。在当时，人们对核糖体的结构知之甚少，也没有可靠的三维重构方法，仅有Jim Lake对核糖体进行“肉眼重构”的粗略的三维模型。Frank教授继而以核糖体为研究对象，在1979-1986年间开发出随机圆锥倾斜（Random Conical Tilt）三维重构方法，最终在1986年获得了大肠杆菌核糖体50S亚基的三维结构，使三维重构技术走向实用。

2012年以前，冷冻电镜的分辨率曾一度受制于传统的CCD探测器和摄影胶片；2012年，直接电子探测相机的成功开发，使得相机的量子探测效率（Detection Quantum Efficiency）大幅提高，开启了“分辨率革命”，带领冷冻电镜技术进入新纪元。Frank教授分享了多个在此之后分辨率达到3Å左右的精彩解析案例。教授指出冷冻电镜技术不仅可以帮助我们预测mRNA和tRNA结合情况、定位分子结合位点等，在本次新冠疫情中，冷冻电镜技术也极大程度帮助科学家确定了新型冠状病毒SARS-CoV2与人体细胞受体结合以及与抗体结合的结构，助力快速鉴定病毒的突变与进化。近年来，每年利用冷冻电镜技术解析的生物大分子结构数量已经超越了核磁共振，并仍在迅猛攀升。

目前冷冻电镜技术依旧在革新之中，Frank教授以团队最近的核糖体翻译终止过程研究为例，讲述时间分辨的冷冻电镜技术（Time-resolved cryo-EM）结合精确控制的喷雾-混合系统可捕捉非常迅速的蛋白质构象变化；图像处理方法流形嵌入（Manifold Embedding）可以分辨出更为细致的动力学变化，进而实现对生物分子连续的结构变化过程的研究。

冷冻电镜单颗粒技术对结构生物学发展的意义非凡，并将在未来学科的发展中继续发挥巨大潜能。

师生互动评论

生命学院博士后周珩：“Frank教授做的核糖体可以解析出很多种构象的结构，但是我所做的机械力敏感的阳离子通道Piezo2却具有高度的柔性，通过三维分类可以分出多种构象，但只有其中最稳定的构象可以解析到近原子分辨率。那么如何解析不稳定的中间构象的高分辨率结构呢？如果中间构象是由两种成分的反应产生的，那么时间分辨的冷冻电镜技术（Time-resolved cryo-EM）可以捕捉到这种中间构象，但是Piezo通道的中间构象是由施加机械力造成的，还有一些离子通道的中间构象是由膜电势变化或者跨膜的电化学梯度引起的，这些中间构象就不能通过Time-resolved cryo-EM获得其高分辨率结构。那么未来单颗粒冷冻电镜能否解决这个问题呢？”

生命学院刘俊杰老师：“我建议需要针对蛋白的性质做不同的处理，如果这种中间构象可以被特定的化学物质所稳定，那么就需要添加这种化学物质来使其稳定在这种构象，以解析结构；对第二个问题，我认为Time-resolved cryo-EM只是一个思路，确实它不能解析机械力、电势变化和跨膜电化学梯度引起的中间构象，但是可以用类似的思路设计专门针对这些离子通道的制样装置，用以解析其结构。”

周珩：“尤其针对跨膜电化学梯度引起的中间构象，可以通过将蛋白重组至脂质体上，人为地控制脂质体内外的电化学梯度，从而解析这类特殊的蛋白的中间构象。”

Frank教授：“第一个问题可采用Manifold embedding的方法，只要这种构象不是占比特别少，就可能通过这种方法解决，但是一般需要收集大量的数据。”

周珩：“Manifold embedding可以研究一种分子机器的多种构象间是以怎样的能量路线发生变化的，的确可以用来研究中间构象，但是并不能通过这种方法直接获取不稳定中间构象的高分辨率结构。”

Frank教授：“的确当前的方法无法解析这类离子通道的开放构象，可能需要具有工程学智慧的研究者开发专门的制样装置以解析其结构。也许第一个开发者就是你。”

生命学院博士生陈康净：“关于单颗粒冷冻电镜技术中结构异质性，Frank教授发表过一种Manifold Embedding的方法，结合我自己的工作，在RSC-NCP复合物结构解析过程中，我们的密度中有一部分尝试了很多计算上和生化上的方法都没有解决。请问Frank教授，Manifold EM方法的主要适用范围如何，以及如何分析结构中的异质性从而选择合适的方法呢？”

Frank教授：“Manifold Embedding方法目前只在核糖体和RyR的结构解析中应用的比较好，对于其他大分子仍在研究。”

王宏伟老师：“其实很多中间构象并不重要，没有太大生物学意义，我们只需要解析一些有重大生物学意义的结构即可。生物大分子的柔性目前也是结构生物学的难题，针对剪接体Manifold EM方法就不太适用。”

生命学院博士生徐家璐：“Frank教授谈到冷冻电镜分辨率革命正在发生；讨论中王宏伟老师预计冷冻断层成像子断层平均法（sub-tomogram average）的近原子分辨率会比想象中更快到来。”

生命学院博士生宋雨桐：“印象比较深刻的是王老师在讨论中提出了一个非常大胆的设想，通过大幅改变电镜设备，利用多电子束同时成像，快速获取数据。”

王宏伟老师总结：“Frank的博士导师是Walter Hoppe，Frank质疑自己导师的观点，独辟蹊径开发了单颗粒重构技术。但是Walter Hoppe也并没有放弃自己的想法，他后来还有另一个学生叫Wolfgang Baumeister，继续他的道路，经过几十年的研究，终于将这一技术也发展起来，成为电子显微学另一主要分支cryo-ET领域的主要奠基人。我鼓励大家在科研的道路上，大胆质疑，坚持求索。”