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霍乱弧菌Ⅵ型分泌系统的效应蛋白对细菌细胞壁的降解机制

王增航董涛

细胞壁对细菌的生存有十分重要的意义，肽聚糖(Peptidoglycan，PG)是大多数细菌细胞壁中都存在的重要结构成分。研究发现，霍乱弧菌Ⅵ型分泌系统(Type VI Secretion System，T6SS)可以分泌具有肽聚糖水解酶活性的效应蛋白到受体细菌中杀死细胞，这类水解酶的作用机制尚未研究清楚。本研究在对PG成分进行研究的基础上，对霍乱弧菌2种毒性效应蛋白TseH和VgrG3作用机制进行研究。研究揭示效应蛋白VgrG3具有降解PG多糖链N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的β(1-4)糖苷键的功能，研究结果为鉴定相关重要效应蛋白的功能以及研究靶向细胞壁的新型抗生素奠定了基础。

摘要

【背景】肽聚糖(Peptidoglycan，PG)是细菌细胞壁的重要组成部分，而霍乱弧菌Ⅵ型分泌系统(Type VI Secretion System，T6SS)可以分泌具有肽聚糖水解酶活性的效应蛋白到受体细菌中杀死细胞，这类水解酶的作用机制尚未研究清楚。

【目的】通过对细菌细胞壁的PG成分进行研究，建立细胞壁PG成分分析方法，并对霍乱弧菌T6SS分泌的2个破坏细胞壁的效应蛋白TseH和VgrG3的作用机制进行解析。

【方法】使用显微镜观察TseH和VgrG3异位表达对宿主细菌生长的影响；纯化大肠杆菌细胞壁，使用透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope，TEM)观察提纯的细胞壁形态；使用纯化的TseH和VgrG3分解消化PG，利用超高效液相色谱-飞行时间质谱(Ultra-Performance Liquid Chromatography-Time-of-Flight Mass Spectrometry，UPLC-TOFMS)分析鉴定消化后的产物成分；通过分析结果推导结构。

【结果】通过透射电子显微镜观察，发现提纯的PG呈现半透明的薄膜泡状；通过UPLC-TOFMS的分析以及逆向推导，得到了提纯的PG被VgrG3水解酶降解之后的3种主要产物，分别是二糖二肽(Disaccharide，Di)、二糖三肽(Disaccharide Tripeptide，Tri)和二糖四肽(Disaccharide Tetrapeptide，Tetra)。

【结论】建立了提纯PG和UPLC-TOFMS分析PG成分的方法，揭示了效应蛋白VgrG3而非TseH可以降解PG多糖链N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的β(1-4)糖苷键的功能。由于攻击细胞壁的效应蛋白在革兰氏阴性细菌中广泛存在，本研究不仅为鉴定这类重要效应蛋白的功能提供了有效的方法，而且对研究靶向细胞壁的新型抗生素也有重要的指导作用。