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乳源耐甲氧西林金黄色葡萄球菌icaA/D基因缺失株的构建及其生物被膜形成能力与耐药性分析
韩雨希 张婷婷 吕丽丽 李槿年
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin Resistant Staphylococcus aureus,MRSA)是一种具有多重耐药性的人畜共患病原菌,形成生物被膜是其重要的耐药机制之一。研究发现ica操纵子调控的胞间多糖黏附素(Polysaccharide Intercellular Adhesin,PIA)通过促进MRSA的黏附与聚集介导生物被膜形成,但icaA/D基因的作用仍不清楚。本研究表明,icaA/D基因缺失可明显降低MRSA的生物被膜形成能力与耐药性,研究为寻找药物作用新靶点提供科学依据。
摘要
【背景】耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin Resistant Staphylococcus aureus,MRSA)是一种具有多重耐药性的人畜共患病原菌,常引起奶牛乳房炎等疾病。形成生物被膜是MRSA重要的耐药机制之一。研究发现ica操纵子调控的胞间多糖黏附素(Polysaccharide Intercellular Adhesin,PIA)通过促进MRSA的黏附与聚集介导生物被膜形成,icaA和icaD基因共表达可显著提高MRSA的N-乙酰葡聚糖转移酶活性,但icaA/D蛋白对MRSA生物被膜形成和耐药性的影响仍不清楚。
【目的】探讨icaA/D基因、MRSA生物被膜形成及耐药性三者之间的相关性,为寻找药物作用新靶点提供科学依据。
【方法】以具有多重耐药性且生物被膜形成能力强的乳源MRSA M5分离株为研究对象,利用同源重组技术构建其icaA/D基因缺失株;利用FITC-ConA染色结合激光共聚焦显微镜观察野生株与icaA/D基因缺失株的生物被膜形成过程与能力;采用微量肉汤稀释法测定14种抗菌药物对野生株与icaA/D基因缺失株的最小抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC)。
【结果】构建了MRSA M5的icaA/D基因缺失株。激光共聚焦显微镜下观察到野生株在培养16 h后形成了一层厚的成熟生物被膜,随后开始解离,直至120 h完全解离;而icaA/D基因缺失株在培养后16 h仅形成一薄层生物被膜,48 h完全解离。10种受试抗菌药物对缺失株的MIC较野生株减小,而且缺失株对8种药物的敏感性由原来的耐药或中介转变为中介或敏感。
【结论】icaA/D基因缺失可明显降低MRSA的生物被膜形成能力与耐药性。
图1 ica操纵子结构示意图
Figure 1 Schematic diagram of the ica operon
图2 同源重组质粒pMD19-T simple-icaAL-icaDR的PCR鉴定
Figure 2 PCR identification of homologous recombination plasmid pMD19-T simple-icaAL-icaDR
图3 基因敲除质粒pBT2-icaAL-icaDR的鉴定
Figure 3 Identification of knockout plasmid pBT2-icaAL- icaDR
图4 基因敲除质粒pBT2-icaAL-icaDR的电转结果
Figure 4 The electroporation result of knockout plasmid pBT2-icaAL-icaDR
图5 可疑菌落的抗性筛选结果
Figure 5 The suspicious colonies screened by resistance of antibiotics
图6 可疑菌落的PCR鉴定
Figure 6 PCR identification of the suspected colonies
图7 icaA/D基因疑似缺失株的组合PCR鉴定
Figure 7 Multiple-PCR identification of the suspected icaA/D gene deletion strain
图8 MRSA M5野生株的生物被膜形成过程
Figure 8 Biofilm formation process of the MRSA M5 wild strain
图9 MRSA M5-ΔicaA/D缺失株的生物被膜形成过程
Figure 9 Biofilm formation process of the MRSA M5-ΔicaA/D strain
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本期制作:赵彬涵
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