蛋白质设施用户揭示哺乳动物辐射轴头部复合体独特的组成与结构

内容来源：中国科学院重大科技基础设施共享服务平台

2021年1月26日，国际学术期刊PNAS在线发表了国家蛋白质科学研究（上海）设施用户中科院分子细胞科学卓越创新中心（生物化学与细胞生物学研究所）丛尧团队与朱学良团队的最新合作研究论文“Distinct architecture and composition of mouse axonemal radial spoke head revealed by cryo-EM”。该研究综合应用冷冻电镜、细胞生物学及生物化学方法，首次解析了鼠源辐射轴头部复合体的3.2 埃分辨率冷冻电镜结构，揭示了高等动物辐射轴复合体在进化过程中的差异，以及辐射轴在纤毛摆动过程中发挥作用的结构机制。  

辐射轴（radial spoke，RS）是从轴丝二联微管伸出的由二十多个亚基形成的超大分子复合体。在运动纤毛或鞭毛中，RS头部接触中央微管（central pair，CP）附属结构，将机械信号和化学信号从中央微管传输到轴突动力蛋白臂，从而发挥协调纤毛运动的功能。尽管RS组分在进化中得以保留，但RS头部复合体在原生动物和后生动物之间的形态差异很大。而且，RS头部组分的基因突变与表现为复发性气管炎、不育和内脏倒位等病征的原发性纤毛运动障碍（primary ciliary dyskinesia，PCD）密切关联。先前对RS的研究主要应用冷冻电子断层重构（cryo-ET）技术，分辨率较低，并且主要集中在低等生物。近来原生生物衣藻的RS结构研究取得进展，但至今尚无高分辨率的高等动物RS结构，制约了对纤毛摆动分子机制的理解。  

研究人员在小鼠原代培养细胞中检测了RS同源蛋白的纤毛定位情况，结合体外生化实验，发现小鼠RS头部复合体由Rsph1、Rsph3b、Rsph4a及Rsph9亚基组成，但缺少Rsph6a和Rsph10b（其直系同源物存在于原生动物的RS头中），与衣藻中的组成成分有很大差异，并且存在组织特异性表达（图A）。表明在进化过程中，生物为了适应不同条件下的运动环境，产生了有一定差异的RS，进而产生了不同的纤毛摆动方式。  

研究人员解析了鼠源RS头部复合体3.2埃分辨率的冷冻电镜结构，并进行了从头建模，此为首个高等动物RS头部复合体的原子结构（图B-C）。该结构呈二重对称的“刹车片”状结构，其中Rsph4a与Rsph9形成紧凑的“身体”，伸展着两个由Rsph1形成的扭曲状的长臂，同时可能通过Rsph3b背侧连接到RS的茎部。发现多种PCD致病性突变发生在可能对该复合体的组装或稳定性至关重要的位点（图D），可能导致辐射轴头部组装异常，进而引起纤毛摆动异常。此外，结合多尺度结构信息的建模分析表明，RS头部既可以通过齿状Rsph4a区域刚性地或通过其伸展的双臂弹性地接触CP的周期性突起（图E），以此优化RS-CP的相互作用和机械信号转导，进而精确控制纤毛的摆动。  

该研究首次解析了在高等动物纤毛运动中起关键作用的RS头部复合体的高分辨率冷冻电镜结构，阐明了辐射轴和中央微管附属结构的相互作用方式，为研究纤毛摆动的分子机制提供了重要的结构基础，并揭示了相关基因突变导致PCD的可能病因。  

国家蛋白质科学研究（上海）设施电镜分析系统在该课题前期tomography数据的筛选提供了重要的技术支持，对海量单颗粒电镜数据的收集和三维重构计算提供了重要的技术支持和机时支撑；质谱系统通过蛋白质复合物组成分析以及交联质谱分析为该成果提供了重要的帮助；数据库与计算分析系统为该研究提供了稳定的计算平台及环境，保障了海量数据计算的快速产出。 

  （A）    mEPC的免疫荧光显示Rsph1，Rsph3b，Rsph4a，Rsph9和Rsph10b（而不是Rsph6a）位于纤毛轴突中。（B-C）RS头部复合体的3.2埃分辨率冷冻电镜结构及其原子模型。（D）已知引起PCD的突变mapping到原子模型上。绿色球代表与PCD相关的突变。（E）RS头部与中央微管附属结构相互作用的两种可能模式。