新型红色荧光多巴胺探针和第二代绿色荧光多巴胺探针的开发及应用

以下内容来源于“维真生物”

多巴胺（Dopamine，DA）作为大脑中重要的神经递质，是一种用来帮助细胞传送脉冲的化学物质。多巴胺调控运动、学习记忆、药物成瘾、脑老化等多种生理过程；帕金森病，精神分裂症，注意力缺陷多动综合症和垂体肿瘤等多种疾病的发生多与多巴胺系统的调节障碍息息相关。因此，研究多巴胺在各种生理和病理过程中的作用尤为重要。

传统测量DA动力学的技术，包括微透析，电化学探针和基于基因表达的分析等，往往缺乏足够的时空分辨率和/或分子特异性。因此，开发一种具有高时空分辨率、高特异性和高灵敏性的感知DA浓度变化的新型工具将有助于我们研究多巴胺系统在生理和病理条件下的不同功能。

近期，北京大学李毓龙实验室、纽约大学Dayu Lin实验室和美国国立卫生研究院Guohong Cui实验室在《Nature Methods》联合发表了题为“Next-generation GRAB sensors for monitoring dopaminergic activity in vivo”的研究论文，报告了新型红色荧光多巴胺探针和第二代绿色荧光多巴胺探针的开发及在细胞、脑切片、果蝇和小鼠中的成功应用。

研究者在已发表的多巴胺探针基础上进行改造和优化，开发出了新型的具有红色荧光且可与其他绿色荧光探针共同使用的多巴胺探针（rGRABDA1m和rGRABDA1h），以及具有更高灵敏度及成像信噪比的第二代绿色荧光多巴胺探针（GRABDA2m和GRABDA2h）。

同时，对该探针在细胞、脑片、果蝇、小鼠中多巴胺动态的检测进行了验证，充分证明了新型多巴胺探针具有高特异性、高灵敏性及高时空分辨率，并可与光遗传学、钙成像和电生理学等技术组合使用，为更深入研究多巴胺的生理和病理功能提供了重要工具。

部分研究结果

1、新型红色荧光DA探针和第二代绿色荧光DA探针的研发及特性

① 新型红色荧光DA探针

作者以多巴胺受体D2R和红色荧光蛋白cpmApple为基础，通过系统优化并从2000多个变体中筛选出了荧光响应最强的探针：rDA0.5。随后，作者通过引入突变先后在rDA0.5的基础上生成了中亲和性的rDA1m，在rDA1m的基础上开发了对DA具有高亲和性的rDA1h以及对DA信号不敏感的对照rDA-mut。数据显示，rDA1m、rDA1h及rDA-mut在HEK293T细胞膜上能良好表达，rDA1m和rDA1h的EC50（半数有效浓度）分别为95 nM和4 nM；用100 μM DA处理时，rDA1m和rDA1h荧光响应（ΔF/F0）分别约为150%和100%，并可被D2R拮抗剂氟哌啶醇（Halo）阻断，而表达rDA-mut的细胞未产生荧光响应。

研究表明在蓝光照射下，基于cpmApple的探针会发生光激活，因而这些探针难以与ChR2联合使用，如经蓝光照射后基于cpmApple的红色荧光钙指示剂jRGECO1a荧光信号上升约为25%，而rDA1m和rDA1h受到的干扰较小（荧光强度降低约10%），因此新型红色荧光DA探针能够与蓝光介导的光遗传激活工具相兼容。此外，与几种常用的红色荧光蛋白相比，新型红色荧光DA探针在HEK293T细胞中的光稳定性更强（图1）。

② 新型第二代绿色荧光DA探针

与此同时，作者在第一代绿色荧光DA探针（DA1m和DA1h）的cpEGFP模块引入随机突变，优化并筛选出高亲和力的绿色荧光DA探针——DA2h ，并先后生成了中等亲和力的DA2m和对DA信号不敏感的DA-mut对照探针。与对应的第一代DA1m和DA1h探针相比，优化后的第二代DA探针DA2m和DA2h对100 μM DA的荧光反应强度增加了2~3倍，对应的EC50分别为90 nM和7 nM（图1）。

图1. 新型红色荧光DA探针和第二代绿色荧光DA探针的研发及特性

③ 新型DA探针的特异性、动力学及与下游信号通路耦合度的测定

特异性 

新型DA探针荧光信号均可被D2R拮抗剂Halo和Etic特异性阻断，但不会被D1R拮抗剂SCH-23390阻断，并且四种DA探针对其它几种神经递质和神经调节剂的荧光响应基本可忽略不计。此外，去甲肾上腺素（NE）与DA结构相似，但是新型DA探针对DA的亲和性是NE的10-20倍，表明新型DA探针对DA具有高度特异性。

动力学 

4种DA探针的响应时间常数τon 均小于100 ms，亚秒级动力学。

与下游信号通路的耦合度 

当在HEK293T细胞中表达时，rDA1h和DA2h几乎不与下游信号通路耦合；对表达探针的大鼠皮层神经元和转基因果蝇进行1~2 h的成像，未观察到荧光强度有显著下降，表明新型DA探针与下游信号通路的耦合度极小。此外，在培养的神经元中表达时，新型红色和绿色DA探针均易定位在细胞膜上，且对DA响应极好，表明新型DA探针可有效应用于神经系统。

综上所述，新型红色和绿色DA探针对DA动态的检测具有高度的灵敏性和特异性，且具有快速动力学，适用于体内多巴胺活性的检测（图2）。

图2.新型DA探针在HEK293T细胞和大鼠皮层神经元中的表达特性

2、新型DA探针测定小鼠脑切片中DA的动态变化

接下来，作者对新型DA探针是否可用于测定小鼠脑切片中内源性DA的释放进行了验证：分别用表达rDA1m、rDA1h和DA2m的AAV（维真生物提供，400 nL/位点）侵染小鼠伏隔核（NAc），两周后检测DA信号。数据显示逐渐增加的电刺激诱导了NAc荧光响应的不断增强，并可被D2R拮抗剂Halo阻断。

为了测定红色荧光DA探针是否与绿色荧光钙探针兼容，作者在小鼠中脑腹侧被盖区（VTA）表达了轴突靶向的GCaMP6s，并在NAc区表达了rDA1m，给予电刺激并对NAc区的钙信号和DA信号同时成像。数据显示，电刺激诱发了GCaMP6s和rDA1m荧光响应的强烈增加，并且二者增加的幅度高度相关；此外，Halo可阻断rDA1m的荧光响应，而对GCaMP6s的信号无影响。

上述结果表明，rDA1m、rDA1h和DA2m探针可检测脑切片中多巴胺能的动态变化，同时新型红色荧光DA探针可与绿色荧光探针兼容，同时进行双色成像（图3）。

 图3.新型DA探针可用于测定小鼠脑切片中DA的动态变化

3、新型DA探针测定自由活动小鼠体内DA的动态变化

作者又验证了新型DA探针是否可用于测定自由活动的动物体内多巴胺的动力学。通过在小鼠黑质致密部（SNc）和背侧纹状体分别表达光遗传工具C1V1和DA探针，测量小鼠背侧纹状体的DA动力学。研究发现，SNc中多巴胺能神经元的光激活使小鼠背侧纹状体的DA探针产生了强烈的荧光瞬时增加，同时该信号可被DA转运蛋白（DAT）阻滞剂哌醋甲酯（MPH）延长，被D2R拮抗剂依替必利（Etic）阻断。因此，新型DA探针可以高灵敏、高特异性检测自由移动的小鼠体内由光基因诱导的DA释放（图4）。

图4.GRABDA探针可以检测光基因诱导的小鼠黑质纹状体中DA的释放

4、新型DA探针测定小鼠交配行为中DA的动态变化

①将AAV-hSyn-DA1h和AAV-hSyn-DA2h分别表达在小鼠NAc的两侧，发现在小鼠交配行为中DA1h和DA2h信号在时间上高度相关，而且第二代DA探针DA2h探针在各交配阶段的荧光响应变化明显高于第一代DA探针DA1h。

②将AAV-hSyn-rDA1m和AAV-hSyn-DA2h共注入NAc中，双色光纤记录显示在小鼠交配行为中rDA1m的荧光动态变化小于DA2h， 但rDA1m和DA2h检测的DA动态变化是一致的，在时间上也高度相关。此外，新型红色和绿色荧光DA探针之间无交叉干扰。  

上述结果表明在小鼠交配行为中新型红色和绿色荧光DA探针检测到的DA动态变化高度一致。

图5.新型DA探针测定小鼠交配行为中NAc脑区的多巴胺动态变化

小结

新型红色荧光多巴胺探针和第二代绿色荧光多巴胺探针可用来测量小鼠脑切片、果蝇和自由移动的小鼠体内DA的动态变化，具有高特异性、高灵敏性和高时空分辨率，还可与光遗传学、钙成像和电生理学等技术结合使用。新型DA探针不仅为多巴胺的功能研究提供了重要工具，也为将来开发具有多种光谱范围以及更高信噪比的神经递质探针提供了宝贵经验。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41592-020-00981-9

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