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近年来，刺激响应型的分子探针已成为化学生物学家研究过程中不可缺少的部分。这些分子探针通过与目标分析物的结合产生一定的响应信号，从而用于金属离子、信号分子和酶活性等的检测。尽管荧光成像在细胞和组织样本中提供了不错的分辨率，但在活体动物中的分辨率明显下降，而利用近红外光（NIR）与超声波相结合产生高对比度的光声（PA）成像方式恰好可以解决该问题。PA断层扫描可以穿透约10 cm的组织，从而获得与深度相关的图像分辨率。因此，设计开发合理的PA刺激响应型探针用于动物疾病模型的研究显得尤为重要。
近日，美国伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校的Jefferson Chan教授课题组设计合成了六种不同修饰的aza-BODIPY染料，并对其吸收、荧光和PA特性进行评估，最终以PA探针的三大标准（吸收位于近红外波段、强烈的PA信号和响应目标刺激时大的PA波长∆λ）筛选出一种良好的构象受限的aza-BODIPY（CRaB）骨架。作者利用该骨架合成了三种不同的刺激响应型PA探针，并在体外实验中证明其产生了更好的比率响应（2-8倍），且与已有的乏氧响应型探针相比进一步证明了CRaB骨架的应用前景。相关成果以“A Conformationally Restricted Aza-BODIPY Platform for Stimulus-Responsive Probes with Enhanced Photoacoustic Properties”为题发表在J. Am. Chem. Soc.上（DOI: 10.1021/jacs.9b06694）。在本文中，作者致力于改善aza-BODIPY骨架的PA强度和Δλ。基于aza-BODIPY的简单修饰即可限制侧边苯环的旋转从而增强吸收能力，作者猜想此类修饰可产生相应的PA信号。至于该修饰如何影响Δλ，正是作者感兴趣之处。作者合成了一组构象受限类似物——缺氧响应型探针HyP-1/red-HyP-1，并评估了这些限制对消光系数、Δλ、量子产率和PA信号的影响（Figure 1）。
首先，作者在亚硝酸钠和乙酸中将甲氧基取代的吡咯亚硝化，然后在乙酸酐中添加胺取代的吡咯得到不对称的氮杂二吡咯亚甲基中间体，其随后与BF2结合得到终产物（Figure 2b）。作者用类似的方法得到了预先设计的red-HyP-1类似物1-6（Figure 2a）。
接着，作者评估了化合物1-6的光物理性质（Table 1），将每种化合物的吸收波长、发射波长、摩尔吸光系数和荧光量子产率与red-HyP-1相比较。此外，作者通过模拟组织散射激发光的过程，收集不同波长下的PA图像（Figure 3）。尽管所有的构象均导致消光系数的增加，作者发现化合物1-3的PA信号具有最大的改善（＞2倍）。接下来，作者研究了每个化合物在缺氧刺激下相关的Δλ值。作者将化合物1-6溶解于含1%三氟乙酸的氯仿中，并测定其质子化后的最大吸收波长（Table 2）。实验结果表明，化合物1、2和5的质子化导致其Δλ比red-HyP-1窄，化合物4和6的Δλ与red-HyP-1相近，只有化合物3具有最佳的Δλ，满足提高PA信号的第三个标准。
由于化合物3（red-CRaB-HyP）满足了改善PA信号的三个关键因素，作者合成并表征了相应的缺氧响应型探针CRaB-HyP，并证实了利用质子化研究所得的Δλ（103 nm）与实际测得的Δλ（98 nm）十分相近（Table 3）。为了进一步确定CRaB骨架是否会优化具有各种取代基的aza-BODIPY的PA信号，作者合成并表征了另外两种CRaB类似物：photoNOD-1（一种NIR活化的NO供体）和APC类似物（Cu(II)探针）（Figure 4）。实验结果表明，基于CRaB骨架的化合物与以aza-BODIPY为核心的相比，具有更优异的摩尔消光系数（1.4-2.5倍）、更强的PA信号（最大约3.2倍）以及更大的Δλ（Table 3），这些性质表明CraB骨架为aza-BODIPY染料的光物理特性提供了可预见的改进，且对于开发刺激响应型的PA探针至关重要。
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（来源：J. Am. Chem. Soc.）
有趣的是，作者发现这些化合物的PA信号与消光系数的相关性较弱（Figure 5b），这与先前对red-HyP-1类似物1-6所测的数据不符。作者猜测吸光系数和荧光量子产率均影响着PA信号的强度，于是作者定义了一个类似的PA亮度因子（PABF），用于研究消光系数和量子产率与PA信号之间的线性关系（Figure 5c）。
随后，作者计算得知每一种CRaB类似物在PA信号增强方面均具有良好的效果（Figure 6a）。基于此，作者进一步比较了HyP-1、photoNOD-1和OMe-APC与其CRaB类似物在靶标刺激后PA信号的变化（Figure 6b-d）。结果表明，HyP-1和photoNOD-1与其CRaB类似物相比，PA信号都有明显的增强。然而，尽管在理论上CRaB-OMe-APC对Cu(II)响应后的PA信号与其CRaB类似物应增加，但实际却并没有改善，可能是因为CRaB-OMe-APC在水中的溶解度较低，妨碍了其与游离Cu(II)的接触。
最后，作者通过研究HyP-1、red-HyP-1、CRaB-HyP和red-CRaB-HyP在体内的PA成像能力评估了CraB骨架在体内改善PA的潜力。作者在1小时内以λblue和λred分别对探针和产物进行PA成像（Figure 7a，b），并用半定量的方式对其PA信号的增强进行分析（Figure 7c），发现CRaB-HyP具有比HyP-1更优异的肿瘤缺氧响应能力。
总而言之，作者基于aza-BODIPY染料和一定的理论基础，第一次集中研究了结构修饰和光物理参数对比率PA信号输出的影响，并设计合成了一系列功能性、响应性PA成像剂，这为合理设计更多分子用于优异的PA成像迈出了重要的一步。![]()