Science：致病菌激活根系内生微生物组抵抗病害的功能

简单介绍一下文章的作者，几位作者来自于荷兰生态学研究所、莱顿大学、瓦格宁根大学的几个研究团队，分别从事微生物生态、生物信息分析方面的研究

2016年，本文的两个通讯作者在Science上发表了一篇短文，提出对病害有抑制作用的土壤是一种特殊的生态系统。

土壤中的致病菌第一次侵染植物，导致疾病爆发，此时的土壤是感病土壤。病害发生后宿主植物富集大量的微生物，与病原菌产生拮抗作用，土壤中的微生物种类增加。
第二年种植的时候，土壤对病害就有了一定的抑制作用，发病率降低，此时土壤就成为了抗病土壤。

那么根系微生物是怎么抗病的？Dangl在一篇综述里总结了微生物帮助植物对抗致病菌的两种途径。直接途径就是根系微生物直接和病原菌相互作用，干扰致病菌的分子机制，例如之前发表的小麦根系假单胞菌分泌一种物质使致病菌组蛋白乙酰化失调，从而抑制真菌生长；另外也有相关文章提到根系微生物组与致病菌竞争生态位。间接途径指的就是根系微生物刺激植物免疫系统，也有两类，一个是根系微生物组作为外界因子诱导植物产生对病菌的抗性，增加植物的敏感性，第二个是通过分子模式识别激活免疫系统

在抗病土壤中，致病菌和根际微生物组的相互作用是怎样的？2015年，本文作者的研究团队对甜菜根际微生物组进行了初步研究，提出了一个假说，认为病原菌侵染后，植物分泌了一些草酸和苯乙酸，吸引了根系微生物组，进而抑制真菌生长，但是具体的机制还不清楚

针对这两个科学问题，作者研究的思路是，
首先通过宏基因组测序和网络分析，研究群落结构和功能基因的差异，找到相关性；
然后再重建Syncom接种实验观察抗病表型，再通过基因定点突变验证功能基因簇对抗病的作用

分别取田间感病土和抗病土。将甜菜幼苗分别种在两种土壤中，在种子萌发七天后，C+R组和S+R组的幼苗根部注射病原菌。
每盆12颗苗，生物学重复4次。四周后，收集没有发病的甜菜幼苗根系。C+R组发病率过高，根系样品不足
对根系表面消毒-过滤根系匀浆后-通过

Nycodenz是一种化学试剂，用于有效地分离细胞。这是通过密度梯度离心方法分离细胞的示意图。细胞在白色带状区。

为了确定S+R组的植物根系确实受到致病菌的侵染，作者分析不同实验组中真菌群落的差异。A图显示三个真菌群落组成显著不同；B-C可以看出，S+R组的Rs菌和其他两组的相对丰度有显著差异。另外从根系鲜重上看，三个处理组收集到的根系鲜重没有明显的差异，说明致病菌在抗病土壤中没有对植物造成明显病害。

基于16S rRNA序列比较物种差异。最大的圈圈代表phylum水平，小的圈圈代表class、family、genus，蓝色是，绿色是，黄色是，
从宏基因组序列中得到的16SrRNA数据中，可以看出
不接加入R菌的S土相比，S+R条件下Proteobacteria 和 Bacteroidetes在根系内生细菌群落中占优势，其中显著富集的十个OTU属于下列几个科

细菌互作网络显示，S+R组的互作网络最复杂，说明当微生物群面临环境扰动（例如病原体入侵）时，可能会发生S+R样本中那些高度连接的网络。
而且80%的互作节点属于拟杆菌的C菌和F菌以及假单胞菌
从测序数据中删除了拟杆菌的序列后，β多样性大大降低，说明拟杆菌可能和抑菌表型相关。

接下来是对功能基因的差异比较。
气泡图中每个气泡代表一个功能基因，气泡的大小代表富集的程度，蓝色表示S+R组富集的基因，绿圈表示在S中富集的，黄色是没有显著差异
在五万多个功能基因中，S组和C组相比只有402个富集基因；而S+r组和S组相比，富集了4443多个功能基因
可以看到Rs侵染后细菌富集了大量功能基因，而且变形菌和拟杆菌中富集的基因最多

下面基于COG注释方法，对拟杆菌富集的功能基因做一个注释。可以看到S+R和S组相比，主要富集了大量的Q类基因，也就是次级代谢产物生物合成相关的基因；S和C相比，主要富集了G类基因，就是碳水化合物代谢相关的基因。下面通过两种分析方法进一步对这两类基因功能进行研究。

首先作者比较了S和S+R两组样品，碳水化合物酶相关基因的表达量差异，不同颜色代表不同分类单元，可以看到在大多数细菌中，Rs侵染后，碳水化合物酶表达量都上升了
然后作者先对C菌中，碳水化合物相关酶的结构域做了相似性分析，不同的颜色代表不同的碳水化合物酶,
糖苷水解酶GHs和糖基转移酶GTs在S+R内生微生物组中更为丰富，并且和疾病抑制相关。
Chitinophagaceae中含有几种酶，具有与真菌细胞壁降解相关的结构域

除此之外，作者也研究了另外两种细菌的蛋白结构域，发现促进几丁质降解的相关酶也出现了富集。
而且这三个细菌富集的这些酶，仅有五个共有的结构域，表明这些内生菌在这个性状上功能冗余性不高。

除了酶之外，作者也详细分析了，真菌侵染后，表达量升高的次级代谢产物生物合成基因簇，简称BGCs
通过这个软件进行注释后，发现共有730个BGCs与不同次级代谢产物生物合成相关，这些次级代谢产物包括NPRS、PKS等等。

在检测到的BGCs中，发现丰度最高的三类细菌中，NRPS基因簇个数最多；33个NRPS基因簇的在不同处理组下的相对丰度比较显示，S+R组丰度显著增加

到目前为止，作者回答了第一个科学问题，就是病原菌侵染对根系微生物组物种多样性和基因多样性的影响，找到了富集的细菌，以及细菌中表达量上升的碳水化合物活性酶基因、以及和NRPS相关的次级代谢产物生物合成基因簇。下面就是如何证明他们对病原菌起到抑制作用？

作者通过分离培养的方法，共培养了900多株内生细菌，通过系统发育分析发现大多也属于变形菌、拟杆菌
同时基于宏基因组数据，拼装了25个细菌基因组，根据看家基因和BGCs特定的基因设计引物，通过PCR从900多个细菌中筛选到4个F菌，具有相关的BGCs，其中有三个BGCs编码NRPS，另外一个编码NRPS-PKS杂化的一种代谢物
另外根据碳水化合物相关的酶GH18基因筛选了3个C菌

将这7个菌和重新组装的25个细菌以及参考菌株放在一起构建系统发育树，结果显示培养的单菌与宏基因组组装的细菌基因组相似度极高

下面是功能试验的流程，Syncom中包含3个C菌和4个F菌
首先在处理组土壤中加入Syncom，播种甜菜种子后，对照组浇水，七天后一半接种致病菌，28天后观察发病情况，收集样品

qPCR分析，用合成菌群处理后的甜菜幼苗内生菌和根际，BGC298, BGC396, BGC471, BGC592, 四个基因簇以及几丁质酶基因（GH18）的表达

和单独的菌群成员相比，Chitinophaga and Flavobacterium组成合成菌群后对真菌侵染植物根系有更强的更一致的保护作用

通过基因敲除技术得到了两个BGC298的突变体，通过Sanger测序，使用特异性引物验证PKS基因缺失