Nat Micro：房刚组揭示细菌表观遗传调节艰难梭菌孢子形成
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艰难梭菌 (Clostridioides difficile 简称 C. diff) 感染是最常见的医院获得性感染之一。仅在美国，每年有大概五十万人感染，造成近50亿美元的医疗负担【1】。老年住院患者中艰难梭菌感染所致并发症和死亡日益增多：百分之十的人会在在确诊的一个月内死亡。艰难梭菌在人们正常肠道环境中并不会致病，但在人体正常肠道菌群遭破坏后(比如说在抗生素治疗之后)，艰难梭菌会迅速增长，并引起严重腹泻。
艰难梭菌能形成孢子(spore)，对热力、干燥、消毒剂等均有极大的耐受性，可存活数月。艰难梭菌孢子在衣服、家具和环境中广泛存在，是广泛传播的一个隐患，同时也是患者在一次成功治疗后再次感染的一个危险因素。人们对于艰难梭菌孢子形成（sporulation）的研究格外重视，希望能对其有效地抑制从而帮助控制艰难梭菌感染的传播和危害。绝大部分研究侧重于艰难梭菌基因组DNA序列的研究，而人们对艰难梭菌的DNA甲基化的功能尚未了解。
图一：艰难梭菌孢子形成过程和示例
人类基因组中最广泛的 DNA 甲基化在胞嘧啶（5-methylcytosine, 5mC）上，而细菌中最常见的DNA 甲基化在腺嘌呤（adenine, N6-methyladenie, 6mA）上。除此之外，细菌的基因组中还有另外一种 DNA 甲基化（N4-methylcytosine, 4mC）。
2012 年, 纽约西奈山医学院房刚和团队在Nature Biotechnology上发表了第一个利用第三代单分子实时测序技术对细菌 6mA 表观基因组的研究，并发现 6mA 可以直接或间接调解调节大肠杆菌 1000 多个基因的转录水平【2】。在过去的七年里，两千多种细菌的表观遗传组被破译：95%的细菌有DNA甲基化；平均每个细菌有三个不同的活跃的DNA甲基化酶和对应的甲基化识别序列（最多的细菌有20多个活跃的，比如幽门杆菌的一些菌株）。2018年，房刚课题组在Nature Reviews Genetics上发表了一篇综述【3】详细的总结各种测序技术，尤其是第三代测序技术在细菌表观遗传组研究中的应用，以及表观遗传学在细菌基因表达和致病菌中的重要功能（详见BioArt报道：Nat Rev Genet发表房刚组细菌表观组综述论文）。
2019年11月25日，房刚课题组在Nature Microbiology杂志上发表文章Epigenomic characterization of Clostridioides difficile finds a conserved DNA methyltransferase that mediates sporulation andpathogenesis，发现细菌DNA甲基化对孢子形成的作用【4】。
此项研究有三个重点：
1．DNA甲基化组合基因组分析发现艰难梭菌基因组有一个高度保守的核心DNA甲基化酶camA。首先，通过对36个重症监护（ICU）病人分离的艰难梭菌样本的基因组和DNA甲基化组测序分析，研究人员发现虽然不同的艰难梭菌菌株有DNA甲基化酶的多样性和不同，而这36个样本却都拥有一个相同的DNA甲基化酶（被命名为CamA）特异性的识CAAAAA (最后一个A被修饰为6mA)。进一步的分析发现GenBank上~300个的艰难梭菌菌株基因组无一例外都有高度保守的CamA，建议CamA可能对艰难梭菌的传播和生存有关键作用。研究团队重新挖掘之前的高通量基于转座子的筛查发现CamA在艰难梭菌孢子形成中很可能起到重要的作用。
图二：艰难梭菌有一个高度保守的核心DNA甲基化酶CamA特异性识别CAAAAA
2．camA基因敲除影响艰难梭菌孢子形成。首先，房刚团队和Tufts大学微生物系Aimee Shen实验室合作，通过基因敲除和针对性的CamA催化位点互补，发现CamA所对应的DNA甲基化丢失，导致in vitro孢子形成中效率减半。下一步，通过艰难梭菌老鼠模型发现CamA所对应的DNA甲基化丢失导致近100倍的孢子数量减弱，表明CamA对于孢子形成的重要性在体内更实际的环境中尤显重要。同时也建议对于致病菌的研究要尽可能进行动物试验。
图三：camA基因敲除影响艰难梭菌孢子形成,尤其是在动物模型中(100倍减弱)
3．CamA的调控主要在艰难梭菌孢子形成初期通过两个孢子形成转录因子介导。以往对于细菌表观遗传的研究大多涉及具体的一个基因，比如说某一个细胞表面蛋白(surface protein)、或某一个毒性因子(virulence factor)等。而孢子形成是一个非常复杂的过程，涉及到不同转录因子在不同时间点的调控。所以该研究使用多时间点转录组分析并结合和转录因子的针对性分析，首先确定了CamA的调控主要在艰难梭菌孢子形成初期（9小时左右）起到关键作用，然后找到两个具体的转录因子(SigE和SigF)起到介导作用。由于CamA在艰难梭菌基因组中高度的保守性，该研究团队进一步发现，除了对孢子形成的影响，CamA还对于艰难梭菌生物被膜形成和细胞长度有影响。
图四：多时间点转录组分析理解DNA甲基化影响艰难梭菌孢子形成的关键时间点和关键介导因子
对于艰难梭菌这一对病人危害极大的致病菌来说，这项研究引入了一个之前未被考虑到的研究角度，即由DNA甲基化起到的表观遗传调控。表观遗传在癌症制药方向有着独特的前景，而在对抗细菌的药物领域尚未被开发。广泛使用的抗生素在杀死致病菌的同时也会杀死人体中对健康有益的细菌，增加感染性疾病和很多其他疾病（比如说糖尿病、肥胖、脑部疾病等）的风险。从这个角度，CamA在艰难梭菌中的高度保守性和重要功能，更重要的是CamA几乎只在艰难梭菌中出现（专属性），或许会成为对抗艰难梭菌的一个新制药靶点。更广泛的来讲，细菌表观遗传学的研究仍然处于初期，有着很多挑战和新的机遇。既包括创新性技术的研发，也包括对未知的调控机制的发现。既包括对致病菌的分析，也包括对人类肠道菌群的分析与理解【5】（详见BioArt报道：华人学者开启DNA甲基化在微生物群落研究中功能性的探索丨NatBiotech）。
同时，房刚课题组正在招聘博士后（计算、实验、或两者结合）:
1）基于第三代测序的新技术开发；
2）表观遗传其在病原菌，宏基因组，真核生物基因组，在疾病研究中的应用。
参考文献
1. Smits WK, Lyras D, Lacy DB, Wilcox MH, Kuijper EJ.Clostridium difficile infection. Nat. Rev. Dis. Primers 2, 16020 (2016).
2. Fang G, Munera D, Friedman DI, Mandlik A, Chao MC,Banerjee O, Feng Z, Losic B, Mahajan MC, Jabado OJ. 2012. Genome-wide mappingof methylated adenine residues in pathogenic Escherichia coli using single-molecule real-time sequencing. Nat Biotechnol 30: 1232–1239.
3. Beaulaurier J, Schadt EE, Fang G,Nature Reviews Genetics, 20, pages157–172(2019)
4. Oliveira PH, Kim A, Sekulovic O, Garrett EM, Trzilova D,..., Tamayo R, Shen A, Fang G, Epigenomic characterization of Clostridioidesdifficile finds a conserved DNA methyltransferase that mediates sporulation andpathogenesis, Nature Microbiology, 2019
5. Beaulaurier J, Zhu S, Deikus G, Mogno L, Zhang X-S,Davis-Richardson A, ……, and Fang G, Metagenomic binning and association ofplasmids with bacterial host genomes using DNA methylation, NatureBiotechnology, 10.1038/nbt.4037, 2018
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