【学术前沿】Science文章：周斌研究组开发细胞增殖示踪新技术发现成体肝细胞来源

北京时间2月26日，国际学术期刊Science 以Research Article形式在线发表了中国科学院分子细胞科学卓越创新中心（生物化学与细胞生物学研究所）周斌研究组的研究成果“Proliferation tracing reveals regional hepatocyte generation in liver homeostasis and repair”。该研究首次开发了能够长时程示踪体内细胞增殖的新技术，利用该技术研究人员发现了成体肝细胞的来源，为肝脏再生及疾病临床治疗研究提供了新思路。

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细胞增殖是多细胞生物体在发育、生理稳态和组织再生中的基本生物学过程，细胞增殖过多或者受阻是许多疾病的致病基础。检测细胞的增殖能力对于发育生物学、肿瘤学、神经科学和再生医学等众多学科的研究至关重要。目前检测细胞增殖的方法主要有两种：（1）基于细胞增殖标记物（如Ki67、pH-H3等）的组织化学染色；（2）核苷酸类似物（如BrdU、EdU等）的掺入。不过，上述检测方法都存在着一定的局限性：在时间上，检测的是某个时间点而非某个时间段内的细胞增殖，就像照相机，只能拍摄某一瞬间的细胞增殖信号，这对于一些增殖能力较低的细胞如心肌细胞、神经元等很难检测到；在空间上，所有类型的增殖细胞都会被无差别的检测，容易造成非目的细胞增殖信号的干扰，信噪比低、分辨率差。因此，开发一种有效检测体内细胞增殖的新技术，实现长时间不间断、组织特异性地标记细胞增殖尤为重要。

周斌研究组长期致力于新型遗传谱系示踪技术的开发与应用，在该项研究中，他们建立了一种检测细胞增殖的新技术—ProTracer（Proliferation Tracer）。作为一种遗传学技术，ProTracer突破了传统检测细胞增殖方法的思维模式，利用广泛使用的细胞增殖标记物Ki67, 在基于研究组前期开发的Dre-rox和Cre-loxP的双同源重组酶介导的遗传谱系示踪技术（He et al., Nature Medicine 2017）基础上，利用Dre-rox启动Cre同源重酶介导的细胞增殖示踪系统进行遗传标记。ProTracer犹如一台录像机，一旦启动，可以实现在数月甚至数年内不间断地记录细胞增殖，这对于检测增殖能力较低的细胞以及评估细胞增殖能力的动态变化过程极其有益。并且，ProTracer可以实现直接检测某一特定谱系细胞增殖情况，避免其他类型细胞增殖信号的干扰，提高了信噪比和分辨率，使检测信号更直观，能够实现从器官整体水平上观察细胞增殖。此外，ProTracer能够实现活体检测细胞增殖，可以在不牺牲动物的情况下，直接在同一个动物上多时间点检测体内细胞增殖，观察细胞增殖的动态变化过程。ProTracer可以广泛地应用于不同组织器官细胞增殖的检测，为发育生物学、肿瘤学、神经科学和再生医学等众多领域的研究提供强大的技术支撑。

ProTracer系统的工作原理

周斌研究组利用ProTracer研究了在成体肝脏生理稳态和损伤再生过程中肝细胞的来源。目前，在肝脏领域，这是一个亟待解决且具有争议的重要科学问题。尽管在某些极其严重的肝损伤情况下，胆管细胞可以转分化贡献形成肝细胞，但是在肝脏生理稳态和损伤再生过程中的肝细胞的更新主要依赖原有肝细胞的自我增殖。肝脏的基本结构单位是肝小叶，肝小叶中的肝细胞由于代谢功能和基因表达等的不同具有较大的异质性，从肝门静脉区到肝中央静脉区大体可分为三区：门静脉周围肝细胞（E-CAD⁺，Zone 1）、中间区肝细胞（E-CAD^–GS^–，Zone 2）和中央静脉周围肝细胞（GS⁺，Zone 3）。有研究认为不同区域的肝细胞增殖能力显著不同, 但究竟哪些肝细胞亚群对新生肝细胞起主要贡献仍存在较大争议，目前主要有以下几种理论：（1）肝细胞流动理论（肝细胞由门静脉侧向中央静脉侧流动，Liver 1985）；（2）中央静脉周围肝细胞理论（Axin2⁺肝细胞，Nature 2015）；（3）门静脉周围肝细胞理论（Sox9⁺肝细胞，Cell2015）；（4）分散式理论（Tert^high肝细胞，Nature 2018）；（5）广泛分布式理论（肝细胞无差别增殖，Cell Stem Cell 2020）。以往的这些研究均是依赖单个分子标记分析肝脏中某一肝细胞亚群的扩增能力，缺少对肝脏整体水平上对所有肝细胞增殖能力的分析，犹如盲人摸象，观察的是事物的局部而非整体，因此很难做出一个全面准确的判断。

图：（A）利用肝细胞特异性的ProTracer标记增殖肝细胞的成体小鼠肝脏。tdTomato⁺的增殖肝细胞呈现出一圈圈的类似“甜甜圈”的形状。（B）利用ProTracer揭示成体肝脏中新生肝细胞（tdTomato⁺）主要来源于E-CAD^–GS^–Zone 2。E-CAD（绿色）；GS（青色）。

为了研究肝脏损伤再生过程中新生肝细胞的来源，研究人员利用ProTracer技术结合肝切、胆管结扎和CCl₄等多种肝损伤模型，发现在肝切模型中，位于Zone 1的肝细胞起始肝脏再生过程，然后Zone 2 的肝细胞迅速增殖。而在胆管结扎和CCl₄急性损伤模型中，则是位于Zone 2的肝细胞起始肝脏再生过程。此外，研究人员利用广谱性ProTracer系统地描绘了肝脏再生过程中其他类型细胞的增殖情况，如胆管上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞。

综上，该研究的亮点在于开发了一种检测细胞增殖的遗传新技术——ProTracer，以全新的视角研究了成体肝细胞的来源，突破了传统思维模式和技术局限性，直观地展现了所有肝细胞类群的增殖情况，首次发现肝小叶中间区域（Zone 2）的肝细胞是成体肝脏在生理稳态中新生肝细胞的主要细胞来源，同时揭示了不同损伤再生模型中新生肝细胞的来源，准确回答了成体肝细胞来源这一重要科学问题。该研究为肝脏损伤修复再生研究开辟了新思路，为肝脏疾病的治疗提供了新的理论基础。

此外，新开发的ProTracer技术具有长时间不间断检测细胞增殖的能力，可以特异性地标记某种特定细胞谱系的细胞增殖，并且实现了不牺牲样品直接活体检测细胞增殖，从多个维度刷新了细胞增殖检测的能力和范围，可以广泛应用于不同组织器官细胞增殖的检测，为发育生物学、肿瘤学、神经科学和再生医学等众多领域的研究提供强大技术支撑。