Developmental Cell | 王佳伟团队在拟南芥单细胞RNA测序领域取得新进展

撰文 | HY

2021年3月15日，国际学术期刊Development Cell在线发表了中国科学院分子植物科学卓越创新中心/植物生理生态研究所王佳伟研究组题为“A single-cell analysis of the Arabidopsis vegetative shoot apex”的研究论文，该研究对拟南芥茎尖组织进行了高通量单细胞转录组测序，众多细胞类群和状态变化在单细胞层面的高效分辨解析为研究茎尖分生组织的细胞分裂和分化过程提供了宝贵资源。

除了下胚轴和子叶，植物的所有地上部分都源自茎尖分生组织（SAM）。对营养SAM的研究揭示了干细胞稳态和叶原基启动由不同的细胞层或区域调控，SAM可被分为三个层区，分别负责形成不同的组织器官。就如同世界上没有完全相同的两片树叶一样，没有两个细胞是完全相同的。尽管目前对茎端细胞的分裂和分化已有大量研究，但对其仍缺乏单个细胞层面的全面解析，使得分生组织功能和过渡放大细胞的分化轨迹未得以清晰阐明。

“在单细胞水平上对基因组进行测序”的单细胞测序技术可以产生高分辨率的细胞类型特异性表达信号，有利于鉴定新的细胞类型和追踪细胞谱系的发育轨迹。高通量单细胞RNA测序（RNA-seq）正成为发育生物学研究的基石，自2019发表的第一篇植物单细胞转录组测序文章，证实了单细胞测序技术在植物中的可行性和有效性，也点燃了单细胞测序在植物学领域的研究热潮（Ryu et al., 2019）。值得一提的是，王佳伟研究组建立了拟南芥根尖的单细胞RNA测序与分析系统，相关成果于2019年发表在Molecular Cell期刊（Zhang et al., 2019），成为国内首篇植物单细胞RNA测序文章。

1. 拟南芥营养茎端细胞图谱的获得

为克服SAM分离技术的困难以及便于区分SAM和叶细胞群，作者收集了500个茎尖和18日龄发育期的叶片分别用于制备原生质体，进行基于液滴的scRNA-seq。通过前期大量处理，成功获得用于后续细胞聚类和注释分析的数据集。在无监督分析条件下，从36,643优质茎尖和叶细胞中获取了23个不同的细胞类群。采用t-SNE和UMAP算法以及三维散点图进行可视化分析，显示出7个广泛群体，分别为叶肉细胞（MC）、表皮细胞（EC）、茎分生组织细胞（SMC）、增殖细胞（PC）、维管细胞（VC）、保卫细胞（GC）和伴细胞（CC）（图1）。依据细胞类型标记基因，每个群体分别包含不同的细胞类群，表明营养茎端由高度异质性细胞组成。

由scRNA-seq分配的细胞类型便于鉴别大量的细胞型特异性或富集基因。本研究结合反向遗传学证实，能够以较高的准确性从得到的转录组数据中发掘细胞类群中新的功能性调节因子，并且茎尖细胞类型特异或富集基因的聚集加速了新基因的发现，为未来拟南芥功能基因组学提供了宝贵资源。

图1. 营养茎端的细胞异质性

2. 表皮细胞和维管组织连续发育轨迹的重构

植物发育的关键步骤之一是茎端通过细胞分裂和分化形成器官。过渡放大细胞作为未分化细胞群体，是处于干细胞与分化细胞之间的过渡细胞。为研究干细胞如何通过过渡放大细胞分化为不同细胞类型的发育轨迹，需要识别和鉴定早期分裂、分化和终末细胞。利用scRNA-seq数据，并基于标记基因表达和伪时间评估的亚细胞类群分配方法，在每个细胞群体中构建了细胞周期和表皮细胞连续体。在重构细胞群体的基础上创建的周期性基因集为未来在单细胞分辨率下鉴别新植物细胞周期成分提供了一个有价值的资源。此外，表皮细胞向气孔分化的连续体数据集以较高的精度揭示了表皮气孔发育过程中转录因子和细胞间信号分子的时空调控，并表明了表皮扁平细胞是高度异质的。

为推测维管组织的发育轨迹，对包含分裂和分化两组亚群的过渡放大细胞类群进行分组。重构VC的过渡放大细胞群分为韧皮部和木质部谱系，基于基因注释和细胞类群富集基因的原位杂交分析显示，两谱系分别由不同的亚细胞类群组成。进一步利用伪时间分析，捕获了木质部和韧皮部的分化轨迹，从基因表达水平的角度阐明了两谱系形成的分子机理（图2）。综合数据表明，scRNA-seq能够获取木质部和韧皮部分化过程中隐藏的过渡细胞状态，并有助于发现新的细胞类型特异性发育调节因子。

图2. 木质部和韧皮部的分化轨迹

3. SMC细胞群体的鉴定

SMC群体可分为10个亚细胞类群，对细胞周期基因的分析表明SMC转录组异质性不受细胞周期状态的支配，且对SMC群体的分析不能揭示明确的细胞分化轨迹。众所周知，STM在SAM中高度表达而在叶原基中受抑制，本研究观察发现，STM不仅在SMC群体中表达，而且在EC中也有表达。STM表达细胞分组以及重新执行无监督细胞聚类，揭示了STM细胞的异质性。不同细胞类群标记基因表达分析表明，SAM干细胞具有不同的分化谱系。此外，使用反向遗传学方法对基因进行功能分析有助于鉴别不同的分化谱系。

4.茎尖和根尖组织在单细胞分辨率下的比较

为在单细胞层面解析茎尖和根尖之间的保守与差异性，对包含60,099个细胞的根、茎scRNA-seq数据集进行联合分析，共获取27个全景细胞类群，多数细胞类群在茎或根之间显示出特异性。此外，茎尖和根尖共享6个维管组织细胞类群，特别值得一提的是，其中的茎尖特异性I12细胞亚群在碳与氮转化协调中发挥重要作用，因此，了解该类群的基因活性可为未来将C3光合作用应用于C4作物奠定基础。

尽管在t-SNE算法聚类中茎与根的EC细胞类群不存在重叠，但茎中表皮标记基因ATML1以及多个参与表皮角质层生物合成的基因也在根尖表皮细胞表达，暗示ATML1也在根系角质合成中发挥重要作用。经染色观察验证，初生和侧生根尖中表达的ATML1确实在时空上与脂肪族聚酯重叠（图3）。上述结果揭示了之前未被识别的茎和根表皮之间的相似性，并证实了ATML1在根EC分化中的作用。

这项工作阐述了拟南芥营养茎端的单细胞分析综合图谱，scRNA-seq技术彻底改革了干细胞类型和分化轨迹的鉴定。本研究通过基因表达标记、基因特征或相关生物过程鉴定了茎端大量的细胞类群和状态变化，这将有助于今后在单细胞分辨率下进行生殖苗的发育研究，并为理解器官形成过程中的细胞命运决定提供资源。另外，为方便使用本研究的数据资源，该研究组建立了一个基因研究网站（http://wanglab.sippe.ac.cn/shootatlas/），便于查询茎尖细胞图谱中的单个基因，且可依据表皮细胞、维管细胞和叶肉细胞的发育轨迹来探索基因表达的动力学。

由于植物细胞较动物细胞偏大且存在细胞壁，因此利用基于液滴的scRNA-seq平台捕获植物细胞存在很大问题，因此，开发较宽尺寸范围的细胞捕获平台以及适宜通用的单细胞制备方案是未来单细胞测序领域重要的研究方向。作者提出单核苷酸RNA测序对于克服以上问题具有很大优势，但在植物细胞多样性与实际分析中存在很多未知与挑战。此外，作者指出scRNA-seq与基于细胞类型标记的细胞分选技术相结合将有助于精确解析SAM的细胞异质性。

中科院分子植物科学卓越创新中心/植物生理生态研究所博士后张天奇为本论文第一作者，王佳伟研究员为通讯作者，博士研究生陈瑜也参与了该项工作。该研究得到了国家自然科学基金、中国科学院战略研究计划 、中国科学院、上海市科学技术委员会、青年精英科学家赞助计划、中国博士后创新人才支持计划的资助。

参考文献：

Zhang TQ, Xu ZG, Shang GD, Wang JW. (2019) A single-cell RNA sequencing profiles the developmental landscape of Arabidopsis root. Molecular Cell, 12: 648-660. https://doi.org/10.1016/j.molp.2019.04.004

Ryu KH, Huang L, Kang HM, Schiefelbein J (2019) Single-Cell RNA Sequencing Resolves Molecular Relationships Among Individual Plant Cells. Plant Physiology 179: 1444-1456 https://doi.org/10.1104/pp.18.01482

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.devcel.2021.02.021