Nature | 胆汁酸代谢物调节Th17和Treg细胞分化

原创阿强 BioArt

撰文 | 阿强

责编 | 兮

胆汁酸为胆固醇来源的天然表面活性剂，由肝细胞通过细胞色素P450氧化胆固醇生成并分泌至十二指肠。哺乳动物肠道内胆汁酸含量丰富，可由肠道细菌转化成大量具有生物活性的小分子库进而调节脂质消化、抗菌防御及葡萄糖代谢【1-2】。图1显示的是胆汁酸生物合成、转运及代谢途径【2】。大多数胆汁酸可经小肠末端的回肠重吸收并循环回到肝脏，而部分胆汁酸可经细菌转化至具有多样化学结构的次级胆汁酸。在正常人群的肠道，胆汁酸可保护肠道上皮细胞并对病原菌产生抵抗，提示这些胆汁酸具有潜在的调节肠道免疫细胞的功能。

图1. 胆汁酸生物合成、转运及代谢途径。哺乳动物体内最丰富的胆汁酸包括初级胆汁酸 (胆酸CA、鹅脱氧胆酸CDCA)及次级胆汁酸(脱氧胆酸DCA及石胆酸LCA)。本图来自参考文献【2】

2019年11月28日，来自美国哈佛大学医学院免疫学系的Jun Huh课题组，联合纽约大学医学院Dan Littman课题组及斯坦福大学Michael Fischbach课题组（共同一作为Saiyu Hang和Donggi Paik）在Nature杂志在线发表了题为Bile acid metabolites control T_H17 and T_reg cell differentiation的研究论文，通过对胆汁酸代谢物化合物的筛选，发现了石胆酸LCA两种不同的代谢产物(3-oxoLCA和isoalloLCA)可在小鼠上调节T细胞功能，提示胆汁酸代谢物可通过直接调控T_H17和T_reg细胞平衡，从而调控宿主免疫。

首先，研究人员为寻找调节T细胞功能的胆汁酸，对近30个初级和次级胆汁酸在内的化合物进行筛选。研究人员使用野生型C57BL/6小鼠(B6Jax小鼠)分离出初始CD4⁺ T细胞，并在T_H17细胞和Treg细胞分化状态下与胆汁酸共培养 (图2) ，发现两个石胆酸衍生物能显著影响T_H17细胞和Treg细胞分化：(1) 3-oxoLCA可抑制T_H17细胞分化，表现在显著降低的IL-17a；(2) isoalloLCA可促进Treg细胞分化，表现在FOXP3表达的增加。进一步研究发现，3-oxoLCA作用于T_H17细胞和isoalloLCA作用于Treg细胞的调节效应具有细胞类型特异性，且两个衍生物均不影响T细胞分化至T_H1或T_H2型T辅助细胞。

图2. 胆汁酸代谢物筛选方法

随后的机制研究实验分两部分。第一部分欲揭示3-oxoLCA如何抑制T_H17细胞分化。此前Jun Huh博士在Dan Littman组博后训练期间，曾发表Nature论文，报道了地高辛及其衍生物可作为T_H17细胞抑制剂，这是因为地高辛具有固醇样结构【3】，通过结合并抑制RORγt来发挥效应。随后，Dan Littman组陆续发现多种具有类似胆固醇结构的化合物可成为RORγt调节剂【4】。因此，研究人员进一步想知道的是，3-oxoLCA在体外系统是否可以与RORγt蛋白相互作用。通过热迁移实验，研究人员证实了3-oxoLCA 可结合至RORγt配体结合域，且平衡解离常数远低于另外两个3-oxoLCA结构类似物。随后的荧光素酶报告实验进一步确认了3-oxoLCA可抑制RORγt转录活性。因此，这一部分实验证明，3-oxoLCA可能通过与RORγt相互作用，抑制其转录活性从而抑制T_H17细胞分化。

第二部分实验欲证明isoalloLCA如何促进T_reg细胞分化。由于LCA具有三个同分异构体，iaoLCA、alloLAC及isoalloLCA，其中isoalloLCA具有最低的logD值，与已报道的鹅脱氧胆酸及熊脱氧胆酸近似，提示isoalloLCA与其他同分异构体相比，亲脂性更低。小鼠分离初始CD4⁺ T细胞培养实验证明了isoalloLCA可提高FOXP3表达，且进一步被FOXP3-GFP报告小鼠分离出的T细胞实验佐证。而FOXP3转录可通过CNS1、CNS2和CNS3三个非编码增强子调节，因此，研究人员通过流式细胞分析进一步证实，isoalloLCA发挥FOXP3促进效应需要CNS3。那么，其他已知的T细胞功能调节因子是否也参与这一促进效应？研究人员研究了其他转录因子，排除了REL、VDR、FXR的参与。此前有报道称，CNS3可能在Foxp启动子区域存在表观修饰，从而调节T_reg细胞发育，因此研究人员进行ChIP分析，发现了经isoalloLCA处理后，Foxp启动子区域的H3K27ac及组蛋白乙酰转移酶p300水平显著增加，而H3K4甲基化不受影响。因此，这部分实验证明，CNS3的作用为建立许可性的染色质结构，使得启动子区域可在isoalloLCA处理后进一步乙酰化。

细胞代谢和表观修饰息息相关，且已知的是，T_reg细胞主要依赖于氧化磷酸化以进行能量生成。因为，下一步需要回答的问题是，isoalloLCA是否影响氧化磷酸化？研究发现，isoalloLCA处理后可显著增加氧消耗量，提示isoalloLCA可增强线粒体活性。为证明这一假设，研究人员分别比较了isoalloLCA对线粒体ROS水平和胞浆ROS水平的影响，并使用线粒体靶向抗氧化剂进行反向验证。进一步通过Foxp3启动子区域H3K27ac的分析，研究人员证实了isoalloLCA促进T_reg细胞分化的两个机制，(1) 提高线粒体ROS产量；(2) 增加Foxp3启动子区域的H3K27乙酰化 (图3)。

图3. 胆汁酸代谢物isoalloLCA促进Treg细胞分化的示意图

最后，研究人员想要回答的问题是，3-oxoLCA和isoalloLCA在小鼠在体模型上是否也可以影响T_H17细胞和T_reg细胞的分化呢？此前，Littman组在Cell发文报道，小肠内的节丝状菌SFB能促进T_H17细胞分化【5】。当时，研究人员比较了Taconic公司及Jackson公司两种来源的小鼠，这是因为Taconic来源的C57BL/6J小鼠 (B6 Tac小鼠) 肠道存在SFB，因此具有大量T_H17细胞，而B6 Jax小鼠因缺乏SFB而具有较少的肠道T_H17细胞 (见图4，来自Littman组该Cell文章) 。

图4. Jackson及Taconic来源C57BL/6小鼠回肠末端肠道菌的比较分析 (来自参考文献【5】)

基于此前期研究，本文中，研究人员对B6 Jax小鼠灌胃给与含SFB的粪便颗粒，随后给与正常饲料或含3-OxoLCA饲料达一周，使得体内3-oxoLCA含量达到足以抑制T_H17细胞分化的浓度 (图5) 。研究人员发现，给与3-oxoLCA能显著抑制回肠 T_H17细胞比率，而天然含有SFB细菌的B6 Tac小鼠在喂食3-oxoLCA后也表现出T_H17细胞比率的显著下降 (图5 a&b) ，而两种条件下喂食3-oxoLCA均不影响T_reg细胞比率。使用近似手段，研究人员发现，另一种代谢物isoalloLCA单独喂食并不足以提高静息态下T_reg细胞比率，而在使用anti-CD3处理后的小鼠上，与3-oxoLCA联合使用能显著增加T_reg细胞比率，与体外实验观察到的3-oxoLCA可进一步增强isoalloLCA的T_reg细胞分化效应 (图5 c&d) 。进一步对肠道菌群的分析提示，3-OxoLCA及isoalloLCA对T_H17及T_reg细胞的调控作用并不影响肠道共生菌，提示3-oxoLCA及isoalloLCA可在小鼠体内直接调控T_H17及T_reg细胞。

图5. 在体实验证明，3-OxoLCA可抑制T_H17细胞发育，而isoalloLCA可提高T_reg细胞

另外，研究人员还对肠道内的胆汁酸代谢物进行了检测，发现3-oxoLCA 和 isoalloLCA 都存在于人体内。更重要的是，在无菌小鼠体内没有发现这两种代谢物，只有普通有菌小鼠体内存在，提示这些代谢物是肠道共生菌的代谢产物。那么究竟哪些细节可以代谢胆汁酸，并且影响体内T细胞功能呢？笔者了解到，与Jun Huh课题组相邻的哈佛医学院另外一个课题组——Kasper课题组，近期将有另外一篇Nature文章来详细解答这个问题。

据悉，在本文的审稿过程中，同行评议认为本文提出了一个新颖而及时的概念，并概述了两种非冗余机制，合成胆汁酸衍生物可通过这些机制调节T细胞的发育和功能。该研究在T_H17 和T_reg细胞分化的背景下表征了次级胆汁酸的功能，这使其成为将肠道微生物衍生产品与肠道功能联系起来的有效机制研究，明确揭示了胆汁酸可发挥非常重要的调节功能，并参与塑造机体免疫系统。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41586-019-1785-z

制版人：珂

参考文献

1. Shapiro et al., (2018) J Exp Med. Bile acids in glucose metabolism in health and disease. 215(2):383-396.

2. Jia et al. (2018) Nat Rev Gastroenterol Hepatol. Bile acid-microbiota crosstalk in gastrointestinal inflammation and carcinogenesis. 15(2):111-6128.

3. Huh et al., (2011) Nature. Digoxin and its derivatives suppress TH17 cell differentiation by antagonizing RORγt activity. 472(7344):486-90

4. Santori et al., (2015) Cell Metabolism. Identification of natural RORγ ligands that regulate the development of lymphoid cells. 21(2):286-298

5. Ivanov et al., (2009) Cell. Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria. 139(3):485-98

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