论文速递：鱼类组蛋白核苷酸的多态性及其在杀鱼爱德华氏菌感染中的作用

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文章导读

科学问题：在水产养殖中，为了提高水产物的产量，提高养殖密度是一个重要的途径。但这就无可避免地要面对鱼类疾病在鱼群中传染的问题。所以研究鱼类抗病性的影响因素，加强鱼的抗病性在水产养殖就显得尤其重要。

研究内容：为了研究鱼类组蛋白基因是否存在核苷酸的多态性以及组蛋白核苷酸多态性是否会影响鱼类的抗病力，本实验以斑马鱼和草鱼为研究对象，通过 PCR 扩增克隆了组蛋白 H2A 的全长开放阅读框；利用过表达技术、菌落平板计数、感染存活分析以及荧光定量 PCR 技术，研究了斑马鱼和草鱼组蛋白 H2A 核苷酸多态性不同变异体在杀鱼爱德华氏菌感染中的作用。

实验材料的选取

斑马鱼幼鱼与草鱼：

50 尾感染有杀鱼爱德华氏菌的斑马鱼幼鱼和

3尾感染柱状黄杆菌体长12cm左右、体质量 50~75g的草鱼

实验方法

实验主体用的PCR技术，实验从六个方面来测定鱼类组蛋白基因是否存在核苷酸的多态性以及组蛋白核苷酸多态性是否会影响鱼类的抗病力。

  1.斑马鱼组蛋白 H2A 核苷酸多态性变异体体内抗菌活性分析

将所构建的斑马鱼组蛋白 H2A核苷酸多态性变异体 zfH2A-1~zfH2A-6 以及空质粒 FLAG(p3×FLAG-CMV-14, Siga-  Aldrich) 稀释到100 ng/μL。将这些质粒分别在 1 细胞期显微注射到斑马鱼的受精卵，典型注射量为 2 nL。注射后的胚胎维持在斑马鱼养殖系统的水中，放置在28°C 水浴箱中孵化。在受精后的第 4 天，将孵化出的幼鱼用于杀鱼爱德华氏菌的感染。再将感染浓度设置为 2×108 CFU/mL。在感染后的第 24 和 48 h，每组分别收集 10 尾幼鱼用于菌落平板计数。

  2.草鱼组蛋白 H2A 核苷酸多态性变异体体外抗菌活性分析

将所构建的草鱼组蛋白 H2A核苷酸多态性变异体 gcH2A-1~gcH2A-8 以及空质粒 FLAG 稀释到 500 ng/μL。将这些质粒分别用 Lipofectamine®2000 转 染 到 过 夜 铺 板 的 24 孔 CIK 细 胞 中 (3×10的五次方/孔)。24 h 后用杀鱼爱德进行感染，再重复与斑马鱼相同的步骤，将感染复数设置为 10。在 感 染 后 的 3 和 6 h， 分 别 用 PBS 清 洗CIK 细胞4 次后，每孔加入500 μL 含有1%(V/V)TritonX-100 的 PBS，室温裂解 20 min。将细胞裂解液充分振荡混匀后，使用 TBS 培养基按照适当的比例进行稀释后，涂布于 TSA 平板上。将 TSA平板倒置于 28 °C 培养 20 h 后进行计数，根据稀释度计算每孔细胞的胞内细菌数量。

     3.荧光定量 PCR 分析

将抗菌组蛋白 zfH2A-5 以及空质粒 FLAG 稀释到 100 ng/μL。将这些质粒分别在 1 细胞期显微注射到斑马鱼的受精卵中，分别在受精后的第 1 和第 5 天，每组分别取 50 尾胚胎或者幼鱼用于 RNA提取。再对来自于不同样品的 2 μg RNA进行反转录，并在 ABI Prism 7 000 sys-tem 仪器上进行荧 光 定 量 PCR。

      4.感染存活分析

   将斑马鱼组蛋白 zfH2A-1、zfH2A-3 以及空质粒 FLAG 稀释到 100 ng/μL。将这些质粒分别在 1 细胞期显微注射到斑马鱼的受精卵中。在受精后的第 4 天，将孵化出的幼鱼用于杀鱼爱德华氏菌的感染，感染浓度为 2×10的八次方CFU/mL。对于zfH2A-1 注射组及相应的 FLAG 空质粒对照组，每组各 3 个重复，每个重复 35 尾幼鱼，每组共计 105 尾 幼 鱼 。对 于 zfH2A-3 注 射 组 及 相 应 的FLAG 空质粒对照组，每组各 3 个重复，每个重复 26 尾幼鱼，每组共计 78 尾幼鱼。感染后每天统计死亡个数，连续统计 6 天。用 GraphPad Prism 6软件绘制感染存活曲线；生存曲线的比较使用Log Rank 检验。

     5.斑马鱼组蛋白 H2A 基因的克隆及其核苷酸多态性变异体序列分析

 扩增斑马鱼组蛋白 H2A 的 cDNA 模板来自于 50 尾感染有杀鱼爱德华氏菌的斑马鱼幼鱼，感染浓度为 2×108 CFU/mL，感染后 24 h 收集 50尾左右的幼鱼 (受精后第 5 天) 用于 RNA 提取。其中扩增引物使用以往报道的引物 H2AF/H2AR[37]。斑马鱼的组蛋白 H2A 核苷酸多态性变异体核苷酸和氨基酸序列的比较使用 Clustal Omega MegA-lign 软件。

     6.草鱼组蛋白 H2A 基因的克隆及其核苷酸多态性变异体序列分析

     扩增草鱼组蛋白 H2A 的 cDNA 模板来自于 3 尾感 染 有 柱 状 黄 杆 菌 (Flavobacterium columnare)、体长 12 cm 左右、体质量 50~75 g 的草鱼，感染浓度为 5×106 CFU/mL，感染后 30 h 收集 3 尾草鱼的鳃组织用于 RNA 提取。草鱼的扩增引物和组蛋白 H2A 核苷酸多态性变异体核苷酸和氨基酸序列的比较使用相同的引物和软件。

实验结果及讨论

1. 斑马鱼组蛋白 H2A 基因的克隆及其核苷酸多态性变异体序列分析的结果

    该实验通过转录组测序的方法，研究了斑马鱼 NOD1 和 RIP2 基因的敲除对免疫信号传导通路的影响 。结果发现 ，NOD1 和 RIP2 基因的敲除显著影响多个组蛋白基因的转录。同时，实验意外发现斑马鱼组蛋白 H2A 存在着丰富的核苷酸多态性序列，具体结果如（图 1)。

     实验还对获得的 10 个差异的斑马鱼 H2A 核苷酸多态性变异体进行序列相似性分析，结果显示，这 10 个 H2A 核苷酸多态性变异体之间的相似性为 90.2%~99.5%，在10个H2A核苷酸多态性变异体编码的氨基酸序列中，仅有6个位点有差异，具体结果如（图2）所示

2. 草鱼组蛋白 H2A 基因的克隆及其核苷酸多态性变异体序列分析的结果

    实验对从草鱼鳃组织中获得至少 10 个 H2A 核苷酸多态性的变异体(图3)进行序列相似性分析，结果显示这 10 个H2A 核苷酸多态性变异体之间的相似性为 93.5%~99.7%。这 10 个 H2A 核苷酸多态性变异体编码的氨基酸序列共有 7 个位点存在差异，具体结果见（图4）

4. 草鱼组蛋白 H2A 核苷酸多态性变异体在杀鱼爱德华氏菌感染中的作用

     实验选取了 8 个草鱼 H2A 核苷酸多态性变异体，在草鱼 CIK 细胞中过表达后，初步分析了空质粒转染的对照组和 H2A 变异体转染的实验组在杀鱼爱德华氏菌感染中的作用，结果如（图6）所示。

5. 抗菌组蛋白 zfH2A-5 对免疫基因的表达调控

    在筛选出来的 3 个斑马鱼抗菌组蛋白 zfH2A-1、zfH2A-5 和 zfH2A-6 中，使用具有中等抗菌作用的抗菌组蛋白zfH2A-5 真核表达质粒，通过荧光定量 PCR 技术研究了 zfH2A-5 对一些抗菌相关的模式识别受体 PRRs 以及抗菌蛋白的表达调控。结果如（图7）

6. 抗菌组蛋白 zfH2A-1 在斑马鱼体内的过表达对感染幼鱼存活率的影响

    在筛选出来的 3 个斑马鱼抗菌组蛋白 zfH2A-1、zfH2A-5 和 zfH2A-6 中，使用具有较强抗菌作用的抗菌组蛋白zfH2A-1 真核表达质粒，将其显微注射到斑马鱼胚胎中；通过过表达以及评估感染存活率的方法研究了抗菌组蛋白 zfH2A-1 在斑马鱼体内的过表达对感染幼鱼存活率的影响。和显微注射空质粒 FLAG 的对照组相比，zfH2A-1在斑马鱼体内的过表达显著提高了感染有杀鱼爱德华氏菌幼鱼的存活率 ，具体情况如(图 8)。