Nature | 徐华强/蒋轶/张岩通过结构生物学方法，阐明磷脂调控5-羟色胺受体分子机制以及抗精神分裂症药物阿立哌唑的药理作用

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在我们的大脑中，有一种快乐神经递质——5-羟色胺（又称血清素，5-HT），它帮助我们感受愉悦、放松和自信，让我们产生满足感和幸福感。5-羟色胺能调节我们的认知与情感，当它的含量升高时，我们会感到愉快；当它的含量下降时，我们则会感觉焦虑、沮丧，甚至产生抑郁症。5-羟色胺的大部分生理功能是由细胞膜上的G蛋白偶联受体（GPCR）介导的，在人体中，有12种5-羟色胺G蛋白偶联受体，这些受体是治疗精神分裂症、抑郁症、偏头痛等疾病的重要药物靶标。科学家们长期致力于5-羟色胺家族受体的结构与功能研究，但是由于技术的困难性，大部分5-羟色胺家族受体的结构未能得到解析。

目前关于5-羟色胺家族受体的功能机制研究还存在几大科学问题：第一，5-羟色胺受体与其他膜受体一样受到细胞膜上的磷脂和胆固醇的调节，但是目前还尚不清楚这些分子是如何调节它们的生理功能的；第二，很多5-羟色胺受体都存在组成性激活，即没有激动剂结合时依然存在一定活性，但这种激活机制未知；第三，作为多种药物的靶点，5-羟色胺受体与不同药物结合的分子机制仍未知。

2021年3月24日，中国科学院上海药物研究所徐华强和蒋轶团队，联合浙江大学张岩研究员团队，共同在Nature 杂志上发表了最新研究成果“Structural insights into the lipid and ligand regulation of serotonin receptors”，这项工作成功实现该领域的多个技术突破，成功解析了三个不同种类的5-羟色胺受体的五个结构，回答了如上三大科学问题。该工作揭示了磷脂PI4P（PtdIns4P）和胆固醇如何调节受体的功能，以及药物阿立哌唑（Aripiprazole）如何识别5-羟色胺受体。阿立哌唑是临床用于治疗精神分裂症的一线用药，同时被用于治疗抑郁症、双相障碍、自闭症等重要精神类疾病。

研究团队采用单颗粒冷冻电镜技术，首次解析了共5个近原子分辨率的5-羟色胺受体与Gi蛋白（抑制型G蛋白）的复合物结构（2.9~3.1埃）（图1）：分别是未结合配体状态下的5-HT1A受体结构、结合内源性小分子配体5-HT的5-HT1A受体结构、结合药物阿立哌唑的5-HT1A受体结构、结合5-HT的5-HT1D受体结构以及结合选择性小分子激动剂BRL-54443的5-HT1E受体结构。

图1. 5-HT1A、5-HT1D和5-HT1E受体与配体和Gi蛋白复合物的冷冻电镜结构

该研究首次在5-HT1A受体复合物的受体与Gi蛋白作用界面发现了磷脂分子，并鉴定该分子为PtdIns4P。PtdIns4P结构中的两条14-16个碳原子的脂肪链与受体跨膜螺旋TM6和TM7以及受体第八个螺旋H8形成了广泛的疏水作用，其极性头部插入受体MT3、TM6和TM7以及Gi蛋白α亚基的α5螺旋形成的口袋（图2a）。研究人员进而借助peptidisc技术，发现多种细胞膜脂质均具有不同程度的G蛋白激活活性，其中PtdIns4P对G蛋白的激活效果最为显著（图2b）。同时，PtdIns4P可发挥正向别构调节作用。除ptdIns4P外，研究人员在受体与细胞膜界面发现了至少10个胆固醇分子，其中2个胆固醇分子包夹了PtdIns4P的一条脂肪链，形成“三明治”样的空间结构（图2c），并验证了胆固醇分子在受体功能调节中的关键作用。

图2. 5-HT1A受体的磷脂和胆固醇调节

在未结合配体的5-HT1A受体结构中，研究人员在配体正向结合口袋中发现了多个水分子的密度。部分水分子排列在与5-HT结构类似的平面上，并与受体形成了稳定的氢键相互作用，其中包括5-HT与受体结合中保守的氢键（图3）。研究人员进一步利用分子动力学模拟证实了该水分子能模拟内源性配体5-HT与受体形成氢键从而介导了5-HT1A受体的组成性激活。

图3. 水分子对5-HT1A受体组成性激活的调控

靶向5-HT受体的选择和非选择性配体已被广泛开发用于临床治疗神经系统等疾病的药物治疗。该研究解析的5个5-HT受体复合物结构为揭示5-HT受体的配体选择性和药物识别的分子机制提供了结构依据。研究发现受体第六个跨膜螺旋（TM6）的6x55位残基是决定BRL-54443选择性识别5-HT1E和5-HT1F亚型的决定因素（图4a和b）。同时，科研人员发现6x54位赖氨酸残基通过与6x55位谷氨酸残基发生电荷作用的间接方式，参与BRL-54443介导的5-HT1E受体激活（图4b）。6x54和6x55位残基在5-HT1E和5-HT1F受体中的高度保守性，也验证了BRL54443对该两类受体的选择性激活效应。此外，6x55位受体残基同时是5-CT选择性激活5-HT1A、5-HT1B和5-HT1D受体的决定因素。

另外，该研究为揭示抗精神分裂症和抗抑郁药物阿立哌唑的选择性提供了重要的结构基础。作为5-HT1A受体的高选择性配体，阿立哌唑对5-HT1B、5-HT1D和5-HT1E受体的活性弱10-1000倍1。该研究发现结合阿立哌唑的5-HT1A受体的TM7胞外端相对其他低选择性受体亚型发生3埃的外移，从而形成了相对更大的配体结合口袋容纳阿立哌唑的喹啉酮基团（图4c）。同时，研究人员发现结合于5-HT1A受体周围的一个胆固醇分子参与阿立哌唑配体结合口袋的形成和维持配体喹啉酮基团附近TM1和TM7构象的作用。这些发现共同揭示了阿立哌唑对5-HT1A受体的高选择性机制（图4d）。

图4. 5-HT1A、5-HT1D和5-HT1E受体配体识别选择性的分子机制

综上，本研究首次解析了未结合配体的5-HT1A受体，以及5-HT1A、5-HT1D和5-HT1E受体与小分子配体或治疗药物及其Gi蛋白复合物的5个近原子分辨率冷冻电镜结构。结合基于结构的功能分析，本研究首次阐述了PtdIns4P和胆固醇分子在5-HT受体的配体识别和G蛋白偶联中的关键作用，并揭示了5-HT受体的组成性激活机制，以及包括抗精神分裂治疗药物阿立哌唑在内的配体选择性识别5-HT受体亚型的分子机制。

由于神经递质5-羟色胺的重要性，中国科学院上海药物研究所徐华强课题组长期致力于5-羟色胺受体的结构与功能研究。2013年，徐华强团队利用X射线晶体学首次解析了5-羟色胺受体1B结合抗偏头痛药物的结构2。2018年，徐华强团队首次解析了5-羟色胺受体1B结合拮抗剂的晶体结构3。结合该团队本次在Nature上发表的五个5-羟色胺受体的冷冻电镜结构，将极大丰富我们对5-羟色胺系统的结构与功能认识，为针对5-羟色胺系统的药物研发提供重要的结构基础。

另外，徐华强团队近期在另一种重要的神经递质多巴胺及其受体的结构与功能研究上也取得了重要进展，2021年该团队连续在Cell、Molecular Cell和Cell Research杂志发表了多巴胺受体D1R、D2R和D3R的冷冻电镜结构4-6，揭示了多巴胺受体与药物的作用机制和变构调节机制。这些成果为未来针对中枢神经系统的药物设计提供了系统性的结构模型。

本课题由中国科学院上海药物研究所徐华强/蒋轶研究团队领衔，联合浙江大学张岩教授团队精诚合作，合力攻关，并在中国科学院上海药物研究所蒋华良院士和程曦副研究员、丹麦哥本哈根大学David E. Gloriam教授、美国温安洛研究所Karsten Melcher教授团队和英国牛津大学Carol V. Robinson教授的协助下完成。上海药物研究所与浙江大学基础医学院联合培养博士生徐沛雨、上海药物研究所与上海科技大学联合培养博士生黄思婕、浙江大学基础医学院博士生张会冰和博士后毛春友、美国温安洛研究所X. Edward Zhou和上海药物研究所程曦副研究员为本文共同第一作者。

文章链接：

https://www.nature.com/articles/s41586-021-03376-8

参考文献：

1 Davies, M. A., Sheffler, D. J. & Roth, B. L. Aripiprazole: a novel atypical antipsychotic drug with a uniquely robust pharmacology. Cns Drug Rev10, 317-336 (2004).

2 Wang, C. et al. Structural Basis for Molecular Recognition at Serotonin Receptors. Science340, 610-614, doi:10.1126/science.1232807 (2013).

3 Yin, W. et al. Crystal structure of the human 5-HT1B serotonin receptor bound to an inverse agonist. Cell Discov4, 12, doi:10.1038/s41421-018-0009-2 (2018).

4 Xu, P. et al. Structures of the human dopamine D3 receptor-Gi complexes. Mol Cell81, 1147-1159 e1144, doi:10.1016/j.molcel.2021.01.003 (2021).

5 Zhuang, Y. et al. Structural insights into the human D1 and D2 dopamine receptor signaling complexes. Cell (2021).

6 Zhuang, Y. et al. Mechanism of dopamine binding and allosteric modulation of the human D1 dopamine receptor. Cell Res, 1-4 (2021).

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