ACS Chem. Biol. | 标签辅助的酶拼接式标记技术

原创 ACS Publications ACS美国化学会

供稿：曾祥梅，北京大学

大家好，本期为大家介绍一篇来自ACS Chem. Biol. 的文章 “Versatile Labeling and Detection of Endogenous Proteins Using Tag-Assisted Split Enzyme Complementation” 。这篇文章是来自加州大学旧金山分校药物化学系Bo Huang教授组的工作。在这项工作中，作者开发了一种标签辅助的酶拼接式标记技术，实现了对内源蛋白的多样化标记和检测。

CRISPR/Cas9介导的基因工程技术使生物学领域发生了一场革命。应用这项技术可以将标签通过染色体重组直接敲入(Knock-in, 以下简称KI)以直接标记目的蛋白，而不易造成类似过表达的高假阳性率的实验结果。其中，一种策略是通过使用荧光蛋白，结合FACS细胞筛选技术，直接分离和富集已敲入标签的细胞。但是，荧光蛋白通常是分子量很大的蛋白，给被标记的蛋白的定位和功能研究带来了很大的干扰。虽然小分子量的多肽标签可以克服这一局限，但是，它们自身不发荧光，与活细胞的FACS分选技术不能很好的兼容。在这篇文章中，研究者对使用了TA-splitHalo(Tag assisted-split HaloTag)系统将多肽标签与含对应连接因子的split HaloTag的荧光基团分别敲入靶标蛋白的染色体基因组中，通过HaloTag分离之后的高效拼接，以实现靶蛋白的标记与检测。HaloTag(以下称为Halo)是一种分子量为33KD的蛋白，可以高亲和力地和特异的荧光配基共价结合而显色，被广泛应用于蛋白荧光示踪。

图1：TA-splitHalo技术的概览和应用。

首先，作者对TA-splitHalo系统进行了精细的设计与筛选。TA-splitHalo系统包含两种正交的肽段标签、相应的连接因子和Halo的N端和C端片段，形成了一种可以高效拼接的Halo。为了鉴定这一体系中有效的标签和连接子，作者采用了流式筛选检测了多种组合和组装。他们先检测了标签GFP₁₁(16个氨基酸)和SpyT(13个氨基酸)，和它们对应的连接子GFP_1-10和SpyC，分别与split Halo融合表达。GFP_1-10能以高亲和力与GFP₁₁相连，组成一个有功能的GFP，而SpyC可以与SpyT形成共价的异肽键。在Halo的N端或者C端，分别有两个连接子，故一共可以形成八种可能的组装形式，如图2A所示。另外，作者也挑选了另一组ALFA/Spy 短肽组合，ALFA为一个含15个氨基酸的短肽，具体策略如图2D所示。作者构建了顺转体系，分别检测了靶标分子的表达和相对应的互补信号，并对可检测到的互补信号在所有转染细胞中的比例进行了量化分析，如图2C，2F所示。与相对应的负对照相比， GFP/Spy和ALFA/Spy构建元件都可以产生很强的互补信号。他们挑选了其中得分最高的构建元件组，包括GS02、GS07、AS02和AS04进行进一步的研究。

图2：TA-splitHalo 构建元件的筛选与分析。

为了检测TA-splitHalo系统是否可以检测KI中可实现成功敲入的细胞，作者分别构建了稳定表达splitHalo构建元件(GS02, GS07, AS02, AS04)以及split GFP_1-10/11。值得指出的是，它们均表达在染色体中的同一区域，以确保它们在各个细胞中的表达量是一致的。如图3所示，这五种细胞系中，都将标签直接靶向了核纤层蛋白laminA/C(LMNA)分子(图3A-C)，在这些KI细胞中，由于实现了splitHalo的高效拼接式标记，四个构建系统中Halo的信号均非常明显，信噪比均比对照组(没有KI的细胞)有明显的提高(图3D-E)，其中AS04有最高的信噪比值3.7。另外，共聚焦成像也进一步验证了所有的splitHalo的拼接信号都是有核膜定位的(图3F)。这一实验表明，AS04标签可以展现出最佳的拼接信号，值得进一步的应用。

图3：评价TA-splitHalo构建元件在KI细胞中的信噪比。

在对Knock-in的检测策略进行了定量分析之后，作者接下来验证了TA-splitHalo是否可以标记并检测特定的蛋白-蛋白相互作用。由于TA-splitHalo标记系统包含两种肽段标签，他们首先检测了这两种标签是否可通过靶标蛋白复合物或多聚化物的拼接形成可被检测的信号。他们以能够同源二聚化的laminA/C分子为模型进行了测试，即将AS04标签对表达在不同等位基因的LMNA基因的N端。在KI细胞中，他们可以检测到比较明显的TA-splitHalo的拼接信号。另外，他们也分析了用TA-splitHalo标记检测杂合多聚体的蛋白-蛋白相互作用，如图4所示，AS04标签对能应用于多个不同的蛋白-蛋白形成的杂聚体的拼接式标记和检测。

图4：TA-splitHalo标记技术可以检测杂合多聚体的蛋白-蛋白相互作用。

接下来，作者进一步检测了GFP/Spy标签对是否可以与ALFA/Spy同时使用。他们首先检测了这两种标签对同时应用于相同靶基因的标记，如图5A-H所示，增加了GFP_1-10/GFP₁₁之后，这一TA-splitHalo体系可以在GFP的通道中也检测出与Halo通道类似的信号。在分选出的阳性细胞中，各个标签的含量(qRNA值)也呈现出与荧光信号一致的分布。这一结果表明TA-splitHalo技术可以对阳性细胞实现多通道的标记与显示。

图5：TA-splitHalo标记支持等位基因的多通道标记和显示。

综上，在这篇文章中，作者开发了一种TA-splitHalo的技术，提供了一种模块化、干扰少、可操纵的拼接式标记方法用于分选KI阳性细胞。作者认为这一策略也可以进一步放大和发展为一种普适性强的 TASEC (Tag-Assisted Split Enzyme Complementation )技术，将splitHalo进一步拓展为split-TEV protease, split-Cre recombinase, split-Firefly luciferase等，以实现更广泛的应用。

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ACS Chem. Biol. 2021, ASAP

Publication Date: March 18, 2021

https://doi.org/10.1021/acschembio.0c00925

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