【教程】microRNA引物设计及过程原理说明
microRNA（miRNA）引物设计及过程原理说明
茎环引物法原理
茎环引物是一种能够自身环化的长引物，它的长度约为45bp。下面是茎环引物的示意图：
茎环引物的使用流程：
第一步：在反转录过程中，茎环逆转录引物（需要自己设计）与miRNA结合，反转录为cDNA；
第二步：在qPCR过程中，茎环结构打开，两条引物与打开茎环结构结合，其中一条引物与茎环引物上的公共序列结合，另外一条与相应的miRNA序列结合（需要自己设计），其他的miRNA也可以使用公共引物。
microRNAs的平均长度23nt左右，所以miRNA引物设计与常规引物设计存在很大差别，以下讲解一下整个miRNA引物设计的过程加上实验流程，以帮助大家对各方面的学习。
首先，引物设计之前先介绍miRNA反转录合成cDNA的过程。
颈环结构已经输入，下面查看颈环结构回形成的那些发夹结构。
选择颈环结构（鼠标点一下）；点击Report下拉菜单；选择Primer Hairpins。
第一个发夹结构是实验所需的结构(dG=-20.4kc/m)。
下面结合has-miR-122-5P合成cDNA的具体过程讲解has-miR-122-5P：UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUGU
将U转T，方便后面使用：TGGAGTGTGACAATGGTGTTTGT
miRNAs的颈环结构引物：是将miRNAs的3’端后6位碱基反向互补添加到经典颈环结构的3’端形成的结构。(自己根据后面图片想一下原因，加6个碱基为经验所授)
has-miR-122-5P的后6位：GTTTGT
has-miR-122-5P的后6位的反向互补序列：ACAAAC
颈环引物序列：
5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAAAC-3’
查看形成的发夹结构（方法前面有讲）
看一下miRNA和颈环引物在一起会是怎么样子：
在含反转录酶及适当的条件下，miRNA和其颈环引物将会合成cDNA链：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAAACACCATTGTCACACTCCA
查看cDNA结构：
我们知道了cDNA的合成过程和序列，同时学习了miRNA的反转录过程。
下面进入重头戏，教大家如何进行miRNA引物设计。首先如果你的前面实验是芯片的就在miRbase上再查看核对一遍，如果是测序实验的需要将miRNA的名字3p或5p及之前的部分复制到miRAN上查找完整序列。将得到的miRNA完整序列复制到一个excel表中，然后使用查找替换将U改为T（一定要记住改换，要不然primer5.0是不认U的）。
为了后面引物设计方便，需要以miRNA序列构建引物，所以需要将miRNA的cDNA的反向互补序列找出。使用primer5.0。
打开File下拉菜单；New；DNA Sequence。
由于正规设计过程中不会先把cDNA序列找出来，所以直接操作过程为先将miRNA序列（U改T）输入，再输入颈环结构序列的反向互补序列。
复制miRNA序列（U改T）；点击primer5.0序列框，使用组合键“Ctrl+V”粘贴序列；选择正向序列。
复制颈环结构序列；点击primer5.0序列框，使用组合键“Ctrl+V”粘贴序列；选择反向互补序列输入Reverse Complemented。
到这一歩cDNA的反向互补序列已经输入完毕，下一歩是在primer5.0上进行引物设计。
1.在序列前面输入9个N（这个是个人习惯，也有人是6个或以上的A，也有人是不输入就直接设计引物的），因为miRNA序列太短，很多时候不能设计出符合实验需要的miRNA，所以在设计正向引物时，一般需要加入3-6个碱基，最多时加入8个碱基，以满足正向引物的设计；
2.点击Function框下的Primer，开始设计上下游引物；
3.有经典颈环结构自然也就少不了常用的下游引物，一般使用CAGTGCAGGGTCCGAGGTAT;CGCAGGGTCCGAGGTATTC。同时还可以适当的在颈环序列中前后移动碱基设计下游引物；
4.自动跳出的显示框中默认选择的是下游引物，正好符合先将常用下游引物输入的操作。下游引物相当比较固定，先输入下游引物对整个引物设计能够提高设计效率。
5.点击框内的Edit Primers；选择所有引物序列；使用组合键“Ctrl+V”输入下游引物，输入方式为反向输入Reversed；点击OK；
点击Analyze分析引物基本信息；点击Prime寻找引物在序列里结合部位；点击OK确定下游引物；
6.点击上下游转换键（图示），开始设计上游引物；点击Edit Primers；
7.去除前面的9个N；点击Analyze；点击prime；查看前面不添加序列时的上游引物状况如何。
在这里的主要问题是Tm值太低，第二个问题是长度稍短。
8.绝大多数情况下在前边添加的序列已GC为主，且在加GC序列时如果序列中间不以AT隔开则TM值上升比值高，同理加AT序列。不要出现GCGC、ATAT、GCCG、或连续4个不同的核苷酸，这些失误会造成引物评分的降低。个人喜欢加CGGGC、GCGGGC、A/TGCCCG等。
9.例如加入ACGGGC（5’端加入，别在3’端）；点击Analyze；点击prime；查看引物的长度和TM值差不多了就行。当然不是全行了，还要查看引物的自身颈环结构，自身引物配对，重要指标为dG（当然还有其他，哈哈）。下游引物不用看了，因为是经典嘛，呵呵。点击OK。
10. 再查看一下引物对之间的匹对情况，加以对上游引物的修改，或者更换下游引物。有必要点击比对框下的All查看所以的匹对情况，呵呵，希望你懂的。
11. 想做好实验的同学可以在DNAstar的PrimerSelect中进一步查看引物对的状况，因为这两款软件让人感觉还是有很大不同的。例如PrimerSelect中引物的Tm值会比primer5.0中底5.5度左右（自己可以试一下）；同时PrimerSelect中对5’端中的匹对情况比较放松（可以用经典下游引物CAGTGCAGGGTCCGAGGTAT看一下）；primer5.0中有的dimer在更变或增减个被核苷酸时会不显示，需要PrimerSelect进一步查看完整的dimer。
12. 最后说一下，这个文本只是对最基本的miRNA引物设计进行说明，很多限制没有向大家说明，如果想做实验的可以联系生物公司让他们帮忙设计一下。或者找比较靠谱的师兄教一下。