连发三篇！王佳伟研究组解析拟南芥/水稻根尖和茎尖单细胞图谱

什么是高通量单细胞RNA测序技术？

自2009年汤富酬研究员在Nature Methods首次报道其开创性工作以来，单细胞RNA测序技术在生物医学领域，尤其是发育生物学和干细胞研究中展现出强大的应用前景。随着单细胞转录组扩增方法的不断优化和核酸测序通量的持续提升，几十甚至几百个单细胞所提供的信息已经不再能满足研究人员的需求。2015年以来，基于细胞条形码标记技术的液滴超高通量单细胞测序技术相继涌现，以哈佛大学的David Weitz等开发的inDrop和Drop-seq系统，以及10X Genomics公司的Chromium平台为代表。液滴超高通量单细胞测序技术所基于的原理是，利用微流控系统产生单个细胞+单个微球的纳升级液滴，每个微球表面包裹有特异的寡核苷酸序列（细胞条形码）对同一细胞来源的RNA分子进行标记，就可以对数千个细胞的cDNA合并建库，省去了对单个细胞的重复操作，大大提升了单细胞测序的通量和单个细胞测序的成本。

Figure 1. inDrop系统示意图【5】

对于多细胞生物来说，细胞基因表达的异质性是导致细胞类型和细胞功能的特化的根本原因。随着单细胞工具的快速发展，单细胞水平的基因表达差异研究已然成为当今生物学研究的热点。其中来自中国科学院分子植物科学卓越创新中心王佳伟课题组发表了国内第一篇植物高通量单细胞RNA测序，解析了拟南芥根尖单细胞图谱，之后又在近期又解析了拟南芥茎尖单细胞图谱，水稻根尖单细胞图谱，具体如下：

1. 2019年4月18日，国际学术期刊Molecular Plant 杂志在线发表了中国科学院分子植物科学卓越创新中心/植物生理生态研究所王佳伟研究组题为"A single-cell RNA sequencing profiles the developmental landscape of Arabidopsis root "的研究论文，在单细胞水平揭示了拟南芥根尖细胞的异质性，描绘了拟南芥发育全景图（developmental landscape）并重构了根尖分生组织细胞的发育轨迹。

王佳伟研究组建立了植物单细胞RNA测序与分析系统，并将这一技术应用在拟南芥根的研究中。通过前期大量预实验，成功捕获了7,695个根单细胞转录组数据。在无监督分析条件下，这些根细胞被归为24个细胞类群。细胞类群注释分析鉴定了一些潜在的新细胞类型，并找到了一批细胞类型标记基因。尤为重要的是，通过t-SNE和UMAP算法展示聚类，重构了根发育的基本轨迹，实现了根分生组织细胞分裂和分化在单细胞水平上的准确投影。进一步利用伪时间（pseudo-time）分析，捕获了根尖分生组织细胞的分化轨迹和过渡态细胞，解析了根分生组织细胞如何通过协调细胞分裂和分化进程逐步形成根尖不同细胞类型的分子机理。此外，通过分析细胞类群对离子吸收和激素响应情况，揭示了不同根细胞类群的响应热图。该研究加深了我们对拟南芥根细胞组成和发育轨迹的认识，将根发育生物学从原先的组织器官水平提升到了单细胞水平。

论文链接：

https://www.cell.com/molecular-plant/fulltext/S1674-2052(19)30133-9

2. 2021年3月15日，国际学术期刊Developmental Cell 期刊在线发表了中国科学院分子植物科学卓越创新中心王佳伟研究组题为"A single-cell analysis of the Arabidopsis vegetative shoot apex "的研究论文。该论文在单细胞水平揭示了拟南芥茎尖细胞的异质性（heterogeneity），通过转录组差异性分析重构了完整的植物细胞周期图谱，并刻画了茎尖干细胞分化成为不同细胞类型的动态连续过程。

尽管单细胞RNA测序技术（scRNA-seq）正日益广泛应用在植物科学研究中，但由于茎尖分生组织体积小、深埋于茎尖、细胞解离难度大，在单细胞水平揭示其异质性和复杂性仍存在巨大技术难度。通过不断尝试、优化调整以及茎尖组织的精准分离，王佳伟研究组成功获得了36643个高质量拟南芥营养期茎尖（vegetative shoot apex）和叶片组织单细胞转录组数据。通过原位杂交和标记基因分析，作者将这些细胞分别注释为叶肉细胞、茎尖分生组织细胞、表皮细胞、保卫细胞、韧皮部细胞、木质部细胞、伴胞细胞和茎尖内皮层细胞等23个细胞簇（cell cluster）。这些细胞簇分属于7个细胞类群（cell population），其中表皮细胞类群由茎尖分生组织L1层细胞发育而来，而叶肉细胞和维管束细胞类群则分别来源于分生组织的L2和L3层细胞。

通过细胞亚聚类分析，发现每个细胞类群中分属G0/G1，S，G2和M期的细胞可以组成一个完整的细胞周期环，展现出细胞周期进程的连续性（continuum）。通过重排过渡态细胞（transit-amplifying cells）和拟时间（pseudotime）分析，进一步重构出气孔细胞、韧皮部筛管细胞、木质部导管细胞的精细发育轨迹图，找到了细胞命运转变过程中的中间态细胞，并描绘了相关的转录调控网络。在此基础上，结合反向遗传学鉴定了几个参与重力反应和木质部发育的新基因。

同时深入考察了茎尖分生组织干细胞类群的异质性。通过对细胞多能性转录因子STM阳性细胞（STM+ cell）的聚类分析，发现由多能性干细胞向表皮、叶肉或维管束的分化是一个连续渐变的过程。一些早期干细胞同时表达STM和叶片/维管束属性基因。最后，通过整合分析茎尖、叶片和根尖单细胞转录组数据集，构建了第一张拟南芥单细胞全景模式图，发现地上和地下部分在表皮细胞和维管束分化中既存在相似性又具有不同的发育特征。

通过单细胞转录组测序技术构建了模式植物拟南芥茎尖和叶片的单细胞图谱（shoot apex single-cell landscape）。该项研究成果揭示了植物细胞的异质性（heterogeneity），在单细胞水平对茎尖和叶片组织进行了精确的分型。找到了处于干细胞和分化细胞之间的过渡态细胞，并在此基础上描绘了茎尖干细胞分化成为气孔和维管束细胞的分化轨迹（trajectory）。揭示了植物细胞周期进程的连续性，鉴定了一些新的细胞周期基因。此外，还阐明了茎尖和根尖细胞在转录组上的相似性和特异性。相关数据库的建立为拟南芥基因表达模式的检索、植物发育生物学和功能基因组学的研究奠定了良好的基础。

3. 2021年4月6日，Nature Communications 在线发表了中国科学院分子植物科学卓越创新中心王佳伟研究组题为" Single-Cell Transcriptome Atlas and Chromatin Accessibility Landscape Reveal Differentiation Trajectories in the Rice Root "的研究论文。该研究系统揭示了水稻根单细胞异质性（heterogeneity），描绘了水稻根表皮细胞（epidermal cell）和基本组织（ground tissue）细胞的分化轨迹，明确了在根尖干细胞分化过程中基因表达与基因染色质可及性（Chromatin accessibility）的相关性，并同时阐明了单子叶植物水稻和双子叶植物拟南芥在根尖细胞类型上的进化保守性。

为了进一步探究单子叶植物根的发育模式，揭示单双子叶植物根的演化规律，张天奇博士将scRNA-seq和ATAC-seq技术应用到水稻根的研究中去。scRNA-seq实验成功捕获了27469个高质量单细胞转录组数据。通过聚类分析，将这些细胞注释为21个不同的细胞类群（cluster），分别对应水稻根表皮、外皮层、厚壁组织、皮层、内皮层、中柱鞘、分生组织、维管组织等细胞类群。通过原位杂交和构建报告基因，发现并验证了一系列全新的细胞类型标记基因。进一步通过重排过渡态细胞和拟时间分析，描绘了表皮分生组织细胞通过分裂和分化形成成毛体细胞（trichoblasts）或非成毛体细胞（atrichoblasts）的发育过程，阐明了基本分生组织祖细胞（ground tissue initial）分化形成皮层、厚壁组织和外皮层的分化轨迹。有趣的是，scRNA-seq和ATAC-seq整合分析显示，一些重要调控因子的染色质开放状态与其基因表达模式呈现时空关联性。尤为重要的是，通过结合反向遗传学实验，发现水稻根分生组织类群特异表达的转录因子OsGATA6参与了水稻根基本组织和维管束组织的发育过程，提示单细胞测序技术可以有效提升作物反向遗传学的成功效率。

最后，通过与拟南芥根单细胞转录组数据集的整合分析，发现二者细胞类型在进化上保守性较低。仅在根毛、木质部、韧皮部等细胞类型中存在较高相似性。进一步深入比较和分析这些保守细胞类型，挖掘出一些潜在的核心细胞类型调控基因。综上，这些研究成果帮助我们绘制了水稻根的单细胞图谱，为今后解析水稻根发育的精细过程和分子机制，人工定制根系以及提高营养吸收能力奠定了良好的基础。

王佳伟研究组合影