ACS Chem. Biol. | 糖工程化偶联抗体实现NK细胞的肿瘤靶向杀伤

原创 ACS Publications ACS美国化学会

供稿：李佼峰，北京大学

大家好，今天为大家分享一篇ACS Chemical Biology文章，题为“Equipping Natural Killer Cells with Cetuximab through Metabolic Glycoengineering and Bioorthogonal Reaction for Targeted Treatment of KRAS Mutant Colorectal Cancer”，该研究由厦门诺康德生物科技公司，厦门大学附属第一医院和密歇根州立大学合作完成。

西妥昔单抗(CET)是一种靶向表皮生长因子受体(EGFR)胞外结构域的人鼠嵌合单克隆抗体，由来自鼠源抗体重链可变区和人源抗体轻链恒定区嵌合而成。由于CET与EGFR的亲和力比其内源配体高，因此CET能竞争性地阻断其内源信号通路，导致肿瘤细胞的死亡。KRAS是EGFR激活信号通路的重要分子，可以促进CET的肿瘤抑制功能；然而KRAS突变体却消除了CET对EGFR信号通路的抑制作用,导致CET对EGFR阳性KRAS突变结肠癌患者的疗效丧失。为了解决这一问题，研究者试图对自然杀伤(NK)细胞进行工程化改造，使其具有肿瘤识别的特异性，以实现靶向杀伤。

图1. 通过代谢糖标记和正交反应将抗体偶联至NK细胞表面以增强其靶向杀伤肿瘤细胞能力

此前，科学家们已采用多种策略增加NK细胞靶向肿瘤的特异性，例如基于基因编辑的嵌合抗原受体(CAR)修饰以及基于化学反应的脂质-DNA修饰，或者基于酶法标记的细胞表面糖结构编辑以增强细胞与CD22、选择素等的结合。然而基因改造可能引入随机突变，诱导细胞向恶性肿瘤发展；部分化学方法会导致NK细胞短暂失去靶向能力。因此为了进一步拓展工程化NK细胞的方法，作者提出可以通过代谢糖标记NK细胞，使其与单克隆抗体偶联，有效提高其肿瘤杀伤效果。

来自PBMC的原代NK细胞在血细胞中含量较少且分离和纯化过程繁琐；而NK-92细胞是一类可在体外培养的永生化细胞系，且其安全性和杀伤作用已被证明。因此，作者选择NK92细胞作为模型细胞进行下游实验。为实现细胞表面的修饰，作者先将NK92细胞与非天然糖N3-SA共孵育；此时，N3-SA可被代谢至细胞表面聚糖中，从而在细胞表面展示叠氮基团(NK92-N3)。单抗与双功能连接臂DBCO-PEG4-NHS反应形成的抗体衍生物，可通过生物正交反应与细胞表面的叠氮反应，实现抗体在细胞表面的共价展示。

图2. 构建人源免疫球蛋白功能化NK-92细胞

A.流式荧光定量(第一组N3-SA处理，第二组N3-SA，anti-hFc-APC处理，第三组N3-SA，hIgG，anti-hFc-APC处理，第四组N3-SA，hIgG-DBCO，anti-hFc-APC处理；B.荧光直方统计图；C.共聚焦成像

首先，作者用荧光标记的人源免疫球蛋白进行概念验证。免疫荧光染色结果表明，只有代谢非天然糖且孵育功能化抗体的组别显示强荧光，即抗体偶联至NK细胞表面(图2A)。为了提高抗体偶联效率，作者对抗体修饰和代谢非天然糖的实验条件进行了系统的评估。其中，linker浓度在0.5 mM左右时，每个抗体分子大约连接10-11个DBCO，且人源免疫球蛋白在0.5 mg/mL浓度下孵育1 h后偶联饱和；此外，作者发现抗体的偶联对细胞的存活没有明显影响。综合考虑偶联效率和细胞存活情况，作者选择0.1 mM N3-SA/million cells的条件进行后续实验。

随后，为了探究细胞标记多种抗体的可行性，作者用DBCO分别将人源(hIgG)、小鼠(mIgG)和兔(rIgG)免疫球蛋白功能化后等量混合，并与NK92-N3共孵育以构建相应工程化NK细胞。检测发现，NK92细胞可以被单种、两种甚至三种单抗同时修饰。该结果证实了偶联方法的普适性，也表明NK92细胞可以被多种抗体同时标记(图3)。由于肿瘤组织的异质性，不同类型的细胞表面的抗原不同，因此靶向多种类型的抗原可以防止肿瘤逃逸。

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图3. 抗体偶联NK92-N3细胞的共聚焦成像

为了证明工程化NK细胞的效用，作者将单抗CET偶联到NK92细胞表面。结果表明， CET经DBCO功能化后可以成功偶联至NK92-N3细胞表面(图4A)。每个NK92细胞表面大概有10⁶个CET分子，且半衰期约为24小时(图4B)。随后通过NK细胞对EGFR阳性KRAS突变人类结直肠癌细胞SW480的杀伤实验，作者发现CET修饰后，与SW480细胞结合的NK92细胞数量增加至原来的3倍，且癌细胞死亡明显增多。当效应细胞(NK92-CET)/靶细胞(SW480) 比值(E/T ratio)增加至20时，NK92-CET杀伤能力最强，SW480细胞死亡最为明显(图5 A)。同时，CET、NK92-N3或者NK92-IgG单独处理则没有毒性，表明CET和NK92细胞对于增强NK92-CET的抗肿瘤活性都十分重要；此外，NK92细胞和未修饰的CET共孵育也和正常NK92细胞没有明显杀伤能力区别，表明CET共价偶联至NK92细胞表面十分重要。为了进一步了解NK92-CET细胞对于SW480细胞的肿瘤杀伤机理，作者表征了NK92细胞的激活信号，穿孔素和干扰素。当结合至SW480细胞时，穿孔素增加，干扰素的分泌显著增多，表明NK-CET细胞处于高度激活状态(图5B)。

图4. 西妥昔单抗偶联至糖工程化NK92-N3细胞

A. 荧光染色表明西妥昔单抗成功偶联至NK92-N3细胞表面；B. 西妥昔单抗在NK92细胞表面存留时间

图5. NK92-CET细胞对KRAS突变SW480肿瘤细胞的毒性增强

A. 不同混合比例下，NK-92(E)对SW480(T)细胞的特异杀伤；B. 不同条件处理时，LDH释放实验表征杀伤效率

最后，为了测试体内疗效，研究者向荷瘤鼠模型尾静脉注射NK92-CET细胞。作为对照， CET抗体或普通NK92细胞被递送至小鼠体内。所有接种的NK细胞用Cy5.5染料标记以进行追踪。与NK92相比，NK92-CET细胞可以有效累积并浸润肿瘤。与未治疗组(PBS处理小鼠组)相比，CET抗体或普通NK92细胞没有明显疗效(图6A)。相比之下，接受NK92-CET细胞的小鼠肿瘤生长明显更慢 (图6C,D)。此外，接受治疗的小鼠没有出现任何体重减轻或器官受损的情况，表明此疗法没有显著毒性(图6B)。

图6. 在小鼠模型中NK92-CET细胞有效抑制肿瘤生长

A. 不同处理条件下，SW480皮下肿瘤的体积；B. 小鼠的体重；C.小鼠肿瘤成像；D.小鼠肿瘤重量

综上，为了赋予NK细胞靶向肿瘤的能力，作者提出新型的糖工程化策略，利用叠氮修饰的唾液酸(N3-SA)对NK92细胞进行代谢标记以获得工程化的NK92-N3细胞，并通过生物正交反应成功偶联炔基功能化抗体，实现多种抗体于细胞表面的共价展示。通过该方法制备的多功能靶向NK细胞可以防止抗原异质性导致的肿瘤逃逸。

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ACS Chem. Biol. 2021, ASAP

Publication Date: April 8, 2021

https://doi.org/10.1021/acschembio.1c00022

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