Microbiology China
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黄芩苷铝胁迫下产肠毒素大肠杆菌内参基因的筛选
孟青艳 尹荣华 叶纯 邱银生
产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)是导致仔猪腹泻的主要致病菌之一,研究发现黄芩苷铝治疗细菌性仔猪腹泻疗效确切,但机制尚不清楚。qPCR是研究各种生物基因表达的重要方法,选择合适的内参基因十分关键。目前,在大肠杆菌中还未能找到广泛稳定表达的内参基因。本研究设计并合成了12个候选内参基因的特异性引物,比较了ETEC在不同浓度黄芩苷铝胁迫下,培养不同时间后各候选内参基因的稳定性情况,最终确定rpoA为ETEC qPCR的最佳内参基因。实验结果为后续利用qPCR法研究黄芩苷铝胁迫ETEC后目的基因功能的表达奠定了基础。
摘要
【背景】产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)是导致仔猪腹泻的主要致病菌之一,黄芩苷铝对ETEC诱导的仔猪腹泻具有良好的治疗效果,但作用机制尚不明了。
【目的】筛选出黄芩苷铝胁迫下ETEC中表达水平最为稳定的内参基因。
【方法】采用qPCR技术测定了12个内参基因16S rRNA、mdh、recA、gapA、gyrA、gyrB、rpoA、rpoB、mdoG、dnaG、secA和fusA在不同浓度(250、500和1 000 μg/mL)黄芩苷铝胁迫下培养不同时间后(4.5 h和6 h)的表达水平,并采用比较Ct值法、geNorm、BestKeeper和NormFinder软件4种方法对12个候选内参基因的表达稳定性进行评估。
【结果】rpoA表达丰度适中,并在多个分析方法中表达最稳定。
【结论】确定了rpoA为ETEC qPCR的最佳内参基因,此研究为后续利用qPCR法研究黄芩苷铝胁迫ETEC后目的基因功能的表达奠定了基础。
图1 总RNA质量电泳图
Figure 1 Quality electrophoresis of total RNA
图2 各候选内参基因qPCR产物的琼脂糖凝胶电泳
Figure 2 Agarose gel electrophoresis of qPCR products of candidate reference genes
图3 候选内参熔解曲线
Figure 3 Melting curves of candidate internal control gene
图4 黄芩苷铝胁迫下ETEC候选内参基因Ct值分布图
Figure 4 Ct distribution for each candidate reference genes of ETEC exposed to baicalin-aluminum complexes
图5 geNorm软件分析候选内参基因稳定性
Figure 5 Stability of candidate reference genes analyzed by geNorm
图6 用于标准化的内参基因最适数目判定(geNorm)
Figure 6 Determination of the optional number of control genes for normalization (geNorm)
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本期制作:赵彬涵
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