【生化】华中科技大学罗亮教授与香港科技大学唐本忠院士合作JACS：双荧光发射AIEgen对双链DNA的特异性识别及SNPs检测

DNA，也就是脱氧核糖核酸，一般是由两条脱氧核苷酸链反向平行盘绕所形成的双螺旋结构，它携带着生物体的所有遗传信息。近几十年来，DNA分析在遗传病、临床诊断和新兴的DNA纳米技术中有着很重要的意义，因此，科学家们在DNA的分析和检测方面进行了大量的研究工作。比如，单核苷酸多态性（SNPs）是生物体中最常见的序列变异形式，是由DNA中的单个碱基对突变引起的。SNPs的准确检测可以帮助区分不同个体之间或者与突变体之间的基因差别，为特定疾病的遗传信息提供临床诊断依据。目前，大部分的DNA检测和SNPs诊断方法都由一个DNA杂交的检测手段和一个信号传导部分组成，比如常见的Molecular beacon。然而，这种杂交检测手段不仅受限于对探针ssDNA(单链DNA)的复杂修饰，而且由于探针ssDNA与待测ssDNA存在可能的不完全杂交，因此，信噪比较低，准确性有限。另外，绝大部分DNA以双螺旋的形式（dsDNA）存在于生物体中,而不是ssDNA。因此，对dsDNA的直接检测将使DNA的分析过程变得更加简单、快速和方便。近日，华中科技大学罗亮教授、孟凡玲副教授和香港科技大学唐本忠院士合作，报道了一种双荧光发射的AIE分子TPBT，它与蛋白，单链DNA及聚阴离子结合时，发出640 nm红色荧光，当其与双链DNA结合时，会出现一个新的540 nm左右的绿色荧光峰，通过研究，作者发现540 nm的绿色荧光峰与DNA的双螺旋结构密切相关。鉴于此，作者可以用它的这一特殊性质来直接检测双链DNA的单核苷酸碱基突变以及DNA的光损伤情况。相关结果发表于J. Am. Chem. Soc.（J. Am. Chem. Soc., 2019, DOI: 10.1021/jacs.9b09239）。   

图1：TPBT的分子结构及SNPs检测原理

（来源：J. Am. Chem. Soc.）

图2：TPBT的聚集诱导发光性能

（来源：J. Am. Chem. Soc.）
 

当TPBT自身聚集或者与牛血清蛋白（BSA）相互作用时，其荧光峰都在620 nm左右。但是当其与小牛胸腺DNA（ctDNA）作用时，0-10 μg/mL时,其荧光峰出现在640 nm左右，11-20 μg/mL时, 537 nm左右出现一个显著增强的新的荧光峰。

图3：TPBT的分子结构及SNPs检测原理

（来源：J. Am. Chem. Soc.）

通过研究，作者发现TPBT和单链DNA，比如A₅₀，相互作用时，只有641 nm的荧光峰出现（图3A）,当加入其互补单链DNA时，537 nm荧光峰大大增强（图3B）。如果将A₅₀和T₅₀预先混合再加入TPBT中，537 nm荧光峰一开始就会出现（图3C），这说明537 nm的荧光峰与DNA的双螺旋结构有关。通过理论计算，作者发现，TPBT可以与dsDNA沟槽结合（图3E），并且结合后TPBT的分子构型会发生改变，使其光谱蓝移（图3F）。

图4：TPBT对双链DNA的高灵敏检测

（来源：J. Am. Chem. Soc.）

作者发现，当在TPBT溶液中加入过量聚阴离子肝素钠（heparin）后，只有640 nm荧光峰出现，再往体系中加入少量ctDNA,537 nm荧光峰就很快出现；但反之，当在TPBT溶液中先加入少量ctDNA，只出现640 nm荧光峰出现，再往体系中加入等过量的肝素钠,537 nm荧光峰不再出现。这是可能是因为640 nm荧光峰来自于TPBT与带负电大分子的静电作用，而537 nm的荧光峰来自于TPBT与双链DNA的沟槽结合。因此，作者先使TPBT与过量肝素钠发生完全静电作用，以此为体系，通过537 nm的荧光峰来检测双链DNA的存在，这一方法可以大大提高检测ctDNA的灵敏度，使其检测限低至1.75 ng/mL。

图5：SNPs检测

（来源：J. Am. Chem. Soc.） 

另外，作者发现这一TPBT-heparin体系还可以有效检测SNPs。利用1型人类免疫缺陷病毒（HIV-1）的DNA片段以及该片段的单个碱基突变作为检测对象，将T突变为A,C,G。与野生DNA片段相比，由于碱基错配会一定程度上影响DNA双螺旋结构，相同浓度下的错配DNA在TPBT-heparin体系的537 nm荧光峰的会明显下降。另外，TPBT-heparin体系同样可以检测出tau DNA的单碱基突变情况。

图6：DNA损伤检测

（来源：J. Am. Chem. Soc.）

进一步地，TPBT-heparin体系还可以用来检测双链DNA的损伤情况。作者将ctDNA置于紫外光下不同时间，使ctDNA出现不同程度的损伤。通过检测发现DNA损伤程度越大，滴定过程中537 nm的荧光上升越慢。这一方法对检测血液中DNA的光损伤同样适用。

综上所述，作者开发了一种对双链DNA特异性响应的双荧光发射AIE探针TPBT，为无标记的SNPs检测和DNA损伤检测提供了一种新的快速、简单的方法。其独特性质在基因突变的高通量筛查，尤其是对一些未知突变位点的基因变异筛查中表现出了很大的应用前景。该工作由高玉婷博士和硕士生何珍艳共同完成，该工作得到了科技部、国家自然科学基金委、中国博士后科学基金和华中科技大学启动资金的资助。

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