【科技前沿】谢黎炜团队发现骨骼肌衰老新机理，为骨骼肌衰老的早期预防和干预提供新靶点和新思路

近日，广东省科学院微生物研究所、华南应用微生物国家重点实验室谢黎炜研究员团队在Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle期刊上发表了文章Transferrin receptor 1 ablation in satellite cells impedes skeletal muscle regeneration through activation of ferroptosis，该研究首次报道了衰老骨骼肌Tfr1-Slc39a14的功能转化可促进骨骼肌铁离子吸收、蓄积并诱发骨骼肌铁死亡的发生。该研究发现可为骨骼肌衰老的早期预防和干预提供新的靶点和干预方案（图1）。

图1：衰老骨骼肌铁离子蓄积和铁死亡模式图

程序性细胞死亡（Programmed cell death ，PCD），是生物体发育过程中普遍存在的一种多细胞生物中的细胞按照预定的程序集体自杀的行为，它包括细胞凋亡和自噬两类，是机体和器官发育/再生过程中清除非必需或衰老细胞及已死亡细胞的重要过程。 

骨骼肌除了是运动的主要器官外，还参与调节全身代谢。肌肉细胞死亡以多种形式发生，如凋亡，坏死和自噬。在再生条件下，细胞死亡、清除和再生受到精准调控，而这些过程的调节异常可导致肌营养不良和肌肉流失。骨骼肌坏死可在各种非病原性条件下发生，如营养不良和局部血循环障碍等。具体而言，急性或生理性损伤会激活细胞凋亡，而细胞凋亡受几种关键分子（如抗凋亡癌蛋白Bcl2，Caspase 3和死亡受体Fas / Apo1 / Cd953）调节。该过程伴有炎症细胞，特别是巨噬细胞的浸润。在再生的初始阶段，M1巨噬细胞在骨骼肌再生过程中，参与细胞因子分泌、纤维碎片清除、微环境铁循环，对调节成纤维前体细胞（FAP）和免疫细胞之间的动态平衡至关重要。纤维碎片清除完成后，M1转化为M2巨噬细胞，有助于分泌抗炎细胞因子并促进再生。骨骼肌的生长和再生依赖于从中胚层形成的成体干细胞——卫星细胞（satellite cells, SCs）。静息的卫星细胞位于肌纤维的基底层和质膜之间，保持自我更新和高再生潜能。当机体受到外部刺激或肌肉损伤后，静息的卫星细胞可被激活，进入细胞周期，增殖和分化，形成新的肌管，进而参与肌肉修复。

铁死亡（Ferroptosis ）是一种新近确定的独特的细胞死亡途径，它参与了多种疾病的发生和发展，例如癌症，缺血再灌注引起的心肌病，变性疾病和中风等。铁死亡是一种依赖于铁离子和活性氧（ROS），通过脂质过氧化物的累积导致细胞损伤的死亡模式。近期研究表明，在心肌病发生发展过程中，Nrf2介导的Hmox1的上调有助于血红素降解释放铁，导致线粒体脂质双层上的脂质过氧化，这是铁死亡引起的心脏损害的主要机制[2]。其他疾病，例如肝纤维化或肝硬化也与铁依赖性细胞死亡有关。肝硬化患者被诊断出铁含量较高和脂质过氧化，但转铁蛋白（Trf）含量较低。在高铁饮食下，肝脏特异的Trf缺失小鼠容易患上由肥大病引起的肝纤维化。此外，还没有在其他器官如骨骼肌中报道过铁死亡的发生。

骨骼肌的生长和再生伴随着各种营养素的精确调节，如氨基酸、矿物质等。微量矿物质作为营养成分，在骨骼肌的生理功能和能量代谢中起重要作用。铁是必需的微量矿物质，是维持骨骼肌正常生理功能（如肌肉细胞分化、骨骼肌生长和肌红蛋白生物合成等）所必需的。一般而言，铁经小肠上皮细胞吸收后，进入血液循环，以转铁蛋白结合铁（TBI）的形式与膜表面转铁蛋白受体1（Tfr1）结合，进而被内吞和吸收。Tfr1蛋白普遍存在于肝脏、脂肪和骨骼肌等组织。

本研究利用转录组测序（RNAseq）比较分析了不同年龄段（2，8，40，60和80周龄）C57小鼠骨骼肌基因表达谱，数据分析显示，Tfr1和Slc39a14表达分别呈现与小鼠年龄增长的负相关和正相关关系。且Tfr1蛋白在衰老小鼠（～80周龄）骨骼肌和肌卫星细胞中表达下调，以及铁离子在衰老骨骼肌中累积、非饱和脂肪酸合成增加以及谷胱甘肽代谢紊乱，并进一步诱发衰老小鼠骨骼肌铁死亡（Gpx4和Fth1表达下调）；铁死亡抑制剂（Ferrostatin-1）腹腔注射能够显著抑制衰老小鼠骨骼肌铁死亡，且显著改善衰老小鼠的运动机能（运动距离和时间）。此外，我们首次报道了伴随骨骼肌衰老，Tfr1 表达降低，Slc39a14表达升高，且在衰老小鼠骨骼肌细胞膜表面富集，增加非转铁蛋白结合铁（NTBI）的吸收，导致骨骼内游离铁离子的累积，诱发骨骼肌铁死亡的发生（图2）。

图2：衰老小鼠骨骼肌铁离子蓄积诱发骨骼肌铁死亡

为进一步研究衰老小鼠肌卫星细胞Tfr1低表达的分子机理，我们构建了肌卫星细胞特异性Tfr1敲除的小鼠，通过腹腔注射tamoxifen条件性诱导Tfr1敲除，在骨骼肌损伤再生后，我们发现肌卫星细胞Tfr1敲除的小鼠出现严重的再生障碍，且伴随铁离子累积、非饱和脂肪酸的合成、谷胱甘肽代谢紊乱以及脂质过氧化，诱发骨骼肌铁死亡的发生（图3）。

图3：肌卫星细胞Tfr1敲除诱导骨骼肌铁死亡延迟骨骼肌再生

图4：衰老骨骼肌铁死亡影响骨骼肌生理机能

为进一步明确骨骼肌铁死亡的生理学意义，我们比较分析了衰老和年轻小鼠骨骼肌和肌卫星细胞特异性Tfr1敲除的小鼠损伤后的转录组测序数据，通过比较分析，从两个数据集中确定了2203个共有的生物靶标。其中，有72个基因显著上调，而132个基因显著下调（图4A-B）。通过KEGG途径富集分析共有的2203个生物标记物，铁死亡，谷胱甘肽代谢和脂肪酸生物合成在衰老骨骼肌中显著富集，表明骨骼肌衰老可能伴有铁死亡。评估血清和TA肌肉非血红素铁水平，与年轻小鼠相比，老年小鼠的铁水平明显升高（图4D）。老龄化的TA肌肉中Tfr1，Nrf2，Gpx4和Fth1表达较低，但Slc39a14表达升高，（TA总蛋白，图4E）。最重要的是，TA膜Tfr1蛋白降低到不可检测的水平，但Scl39a14的表达水平明显更高（图4E）。这些观察结果表明，Slc39a14可能促进老年骨骼肌中NTBI的吸收，从而导致TA肌肉中的铁蓄积，从而激活肥大症。同时，在肌内注射CTX后，将作为ferroptosis抑制剂的Ferrostatin-1腹膜内注射到老年小鼠中，以诱导损伤和再生。注射后三十天显著改善了小鼠跑步能力，例如跑步时间和距离（图4F）。通过检测衰老人群骨骼肌中铁死亡通路是否活化，利用荧光定量PCR检测来自年轻（小于30岁）和衰老（大于60岁）个体骨骼肌内铁代谢，脂肪代谢和铁死亡基因表达（图4G-I），这些数据表明，除已知的细胞死亡形式（包括细胞凋亡，自噬和坏死病）外，铁死亡是老年骨骼肌中一种尚未识别和报道的细胞死亡形式。

总而言之，目前的研究表明，肌卫星细胞中的Tfr1缺失会导致骨骼肌的再生障碍，并诱导铁死亡的发生。此过程伴随Tfr1-Slc39a14功能转换，其介导非转铁蛋白结合铁（NTBI）吸收导致骨骼肌中游离铁离子的蓄积。我们在衰老小鼠的骨骼肌中也观察到了相同的表型，这为开发防止骨骼肌衰老和相关疾病的治疗策略提供了新靶点和新思路。相关研究成果发表在《Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle》。铁死亡抑制剂在制备改善机体运动功能的制剂中的应用申报中国国家发明专利1件（专利申请号：2021101825711）。

本研究的主要完成人，第一作者丁红荣是广东省科学院微生物研究所，华南应用微生物国家重点实验室谢黎炜研究员与广东医科大学朱肖教授联合培养的硕士研究生，共同第一作者陈淑洁博士是谢黎炜研究员的博士后，潘潇寒是谢黎炜研究员的研究助理，代晓霜博士是深圳华大农业应用研究院研究员，负责样本的测序工作。本文的共同通讯作者复旦大学陆炎教授、广东医科大学朱肖教授和南京医科大学附属第一医院的胡军教授参与课题的设计与讨论。

原文链接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/jcsm.12700