Science同期三连发，蛋白组学/磷酸化修饰组揭示睡眠需求机制

原创 Dr.Proteomics 精准医学与蛋白组学

本文由景杰学术团队原创解读

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睡眠与节律是近年来炙手可热的研究领域，睡眠现象从无脊椎动物到哺乳动物中广泛存在，是一种对大脑必不可少的时间巩固行为：学习和记忆受益于睡眠，而缺乏睡眠会导致认知障碍，只有通过睡眠才能恢复，但其分子机制仍是现代生物学界一个巨大的未解之谜。

睡眠睡眠需求不仅取决于清醒的持续时间和强度（稳态因子调节），也受到昼夜节律的调节，遗憾的是目前对于稳态因子和昼夜节律是如何互作调控睡眠仍不十分清楚。2018年6月，国际顶级学术期刊Nature报道了睡眠的稳态调控机制。日本筑波大学国际综合睡眠医学研究所刘清华课题组运用蛋白组学与磷酸化组学的研究方法，从“磷酸化/去磷酸化循环调控”角度提出了睡眠分子调控的新理论，研究揭示SNIPP磷酸化是睡眠需求的分子标记，SNIPP的磷酸化-去磷酸化循环是睡眠-觉醒稳态与突触平衡的主要调节机制。

今天分享的这三篇睡眠需求的蛋白质组学研究文章，于2019年10月11日同期发表于国际顶级学术期刊Science上。

前两篇文章均来自德国慕尼黑大学医学院Maria S. Robles教授，苏黎世大学Steven A. Brown教授的合作团队。研究人员结合蛋白质组学、磷酸化组学、转录组学技术，对小鼠前脑神经突触进行分析，首次全面的描述了在一天之中小鼠体内的数千种mRNAs、对应的蛋白质以及磷酸化位点的节律性变化，揭示了睡眠的恢复作用与神经元活动和突触可塑性之间紧密关联，同时探索了睡眠需求的稳态因子与昼夜节律之间的互作关系。

DOI: 10.1126/science.aav3617

DOI: 10.1126/science.aav2642

Science同期还发表了威斯康星大学Chiara Cirelli题为Linking the need to sleep with synaptic function的Perspectives文章，对睡眠需求与突触功能进行了总结和展望。

DOI: 10.1126/science.aay5304

文章题目：

Sleep-wake cycles drive daily dynamics of synaptic phosphorylation

内容简介：

昼夜节律性磷酸化能够调控外周器官的细胞过程，但其在脑功能和突触活动中的作用仍知之甚少。系统地揭示突触蛋白内磷酸化动力学的大小和来源，对于评估突触功能缺陷以及了解时间对脑病理的影响是十分必要的。

为了全面表征由昼夜节律和睡眠依赖驱动的突触区室中的磷酸化节律，研究人员将研究重点集中在小鼠前脑的突触上。该区域既是学习和记忆的关键区域，也是许多受睡眠剥夺影响的认知功能的关键区域。从横跨24小时的小鼠前脑中分离了突触神经小体，并利用先进的基于质谱的蛋白质组学和磷酸化修饰组学对其进行了分析。

图1 小鼠突触神经小体的全局式磷酸化修饰组定量分析

作者准确地定量了8000多个磷酸化肽段，对应约2000种蛋白质。突触组分和激酶中超过30% 的磷酸化呈现节律波动，并在黎明时从清醒到睡眠的转变和黄昏时从睡眠到清醒时达到峰值(图2 B、C) 。除了重要的突触组分如离子通道、受体和脚手架蛋白以外，大量的激酶也是以时间依赖的方式被磷酸化调节的——有一半以上的激酶在一个或多个氨基酸残基上表现出节律性磷酸化。突触的活性在时间上受磷酸化的调控，例如在黎明时的突触抑制和在黄昏时的兴奋。作者还进一步通过应用4小时的睡眠剥夺来干扰睡眠-清醒周期，用以评估昼夜节律和睡眠驱动的信号。睡眠剥夺消除了前脑突触中98%的节律性磷酸化，但在起突触运输和脚手架作用的41个核心磷酸化蛋白中，昼夜节律周期没有受到影响(图2 D、E) 。

图2 日常的睡眠-清醒周期驱动突触的磷酸化

总的来说，研究表明响应睡眠-清醒信号的磷酸化激酶的激活是突触磷酸化动力学的核心驱动因素。突触的增强与清醒(活动)和睡眠(休息)存在关联。睡眠剥夺导致的高睡眠压力几乎完全消除了突触中日常磷酸化循环的两个峰值。因此作者推测，睡眠和清醒依赖机制下调节突触内稳态和功能的关键驱动因素，可能是由磷酸化所介导。

文章题目：

The forebrain synaptic transcriptome is organized by clocks but its proteome is driven by sleep

内容简介：

在脑内睡眠通常与内源性昼夜节律同步发生，并且两者都会导致每日mRNAs的全局波动。尽管目前有报道，神经元能够主动地将mRNAs运输到远处的树突和轴突中，随后进行局部的蛋白质翻译。突触大小和总蛋白丰度均由清醒和睡眠来动态调控。然而脑中突触转录本的昼夜节律和睡眠依赖性调节以及它们的功能重要性仍然知之甚少。

在该研究中，德国慕尼黑大学与苏黎世大学的合作团队，结合基于质谱(MS)的定量蛋白质组学与深度测序方法，分析了正常睡眠和高睡眠压力下小鼠前脑突触神经小体的转录本和蛋白质，揭示其日常节律性波动的起源和功能。

图3 前脑突触的转录组由生物钟调控，但其蛋白质组则由睡眠驱动

研究发现，67%的突触mRNAs表现出昼夜节律性波动，平均振幅约2倍。93%的mRNAs仅在突触神经小体中波动，这表明波动完全源于转录后。GO分析强调黄昏前（图3 D上）和黎明前（图3 D下）的突触功能在时间上完全分开，其中黎明前的转录本与新陈代谢和翻译有关，而黄昏前的转录本与突触传递有关，证明了这种时间把控对于突触功能和能量稳态的功能相关性。总的说来，75%的突触蛋白的波动伴随着它们节律性的mRNAs，表明局部突触翻译的关键作用。

而在高睡眠压力条件下，只有25%的mRNAs保持一致的昼夜节律，而大多数突触蛋白组在一定程度上保持昼夜节律（图3 B、C）。睡眠剥夺完全消除了蛋白质波动，但对转录波动影响不大。综上，作者为睡眠和昼夜节律之间的关系提供了一种简单的范式——生物钟调控突触mRNAs的节律性波动，这些mRNAs随后受睡眠-清醒周期驱动而被翻译成蛋白质。

文章题目：

Linking the need to sleep with synaptic function

内容简介：

Science同期还发表了威斯康星大学Chiara Cirelli题为Linking the need to sleep with synaptic function的Perspectives文章，对前两篇文章的研究进行了总结和展望。

有研究表明，睡眠的恢复作用与其影响神经元活动和突触可塑性的能力有关。突触是神经元可塑性的基础；在成人的大脑中，突触可以在几分钟或几小时内改变其强度和大小，来应对新的感受和学习。Maria S. Robles等人采用生化方法分离了突触神经小体，并进行了深度的转录组测序和基于质谱的蛋白质组学和磷酸化修饰组学检测，首次全面的描述了在一天之中小鼠体内的数千种mRNAs、对应的蛋白质以及磷酸化位点的节律性变化。

图1 睡眠需求与突触功能紧密相关

结果显示，正常睡眠小鼠的突触中67%的mRNAs、12%的蛋白质和超过50%的磷酸化蛋白表现出昼夜节律变化，并在黄昏或黎明达到峰值。而在睡眠剥夺的小鼠中，mRNA的日常节律要么不受影响，要么减少(但并非消失)，但是几乎所有的蛋白和磷酸化蛋白的日常节律都完全消失了。这表明生物钟机制允许在黄昏和黎明前后特定的“高峰时间”积累转录本，而与是否睡眠无关。与之相反，蛋白和磷酸化蛋白的周期性循环则只受睡眠-清醒的驱动，而与一天中的时间无关。

值得注意的是，每日丰度变化的突触蛋白与磷酸化水平变化的突触蛋白不同，这说明，需要进行蛋白质丰度和磷酸化状态两方面的分析，以充分了解睡眠压力如何影响突触功能。此外，在突触中检测到的转录、蛋白质和磷酸化修饰的变化，与使用整个组织时检测到的变化之间几乎没有重叠。这一发现强调了突触是一种特殊的神经元区室，其受昼夜节律和稳态因子的影响方式，与神经元和胶质细胞的细胞体有着明显区别，表明取材时区室划分的重要性。

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