Nature子刊 | 中山大学陈守登／单鸿／肖非／廖化新团队发现首个可抑制COVID-19补体过度激活的全人源新冠病毒N蛋白抗体

图1：研究工作论文首页

图2：抗体的筛选及其特点

此外，研究人员通过初步的抗原表位鉴定（NTD、CTD、N-FL），和抗原抗体亲和力的测定，筛选出了结合N蛋白全长和与抗原亲和力最强的抗体nCoV396（KD=1.02 nM）【图3】。

图3:N蛋白抗体抗体对抗原的反应性和亲和力

紧接着，研究人员利用X线衍射的方法解析了N-NTD(49-173aa)和nCoV396Fab复合物高分辨率的晶体结构（PDB:7CR5）。结果显示，抗体利用其轻链CDR1、CDR3和重链CDR1、CDR2、CDR3，通过亲水和疏水相互作用识别N-NTD的C端（159-163aa）区域。NTD与抗体结合的Q163，L167和K169位点在冠状病毒中相对保守，提示该抗体可以结合其他高致病性冠状病毒的N蛋白，具有潜在广谱的应用前景。SPR分析也证实nCoV396Fab同样可以和SARS（KD=7.26nM）和MERS N蛋白结合（KD=12.6nM）。通过进一步与NTD单体（PDB:6M3M）的结构比对，研究人员发现，N蛋白结合抗体之后，NTD的C端有大约80º远离手掌区的摆动，以暴露出抗原表位，这可能导致N蛋白的NTD和CTD相对位置的变化。同时，NTD的手指区域从RNA结合区域向外移动了7.4 Å,导致了N蛋白结合RNA口袋的扩大，提示nCoV396可能影响了N蛋白结合RNA的能力【图4】。

图4: mAb nCoV396和SARS-CoV-2 N-NTD复合物结构

为了进一步验证N蛋白抗体nCoV39的功能，研究人员自主开发了一种离体检测补体过度激活状态的方法。通过利用自身免疫性疾病且C3或者C4升高的病人血清，加入MASP-2特异性荧光淬灭底物(2Abz-SLGRKIQI-Lys(Dnp)-NH2)，用酶标仪检测初始反应速率(V₀)，计算最大反应速率（Vmax）和米氏常数（Km）以反映补体激活状况。当体系中加入了SARS-CoV-2 N-FL后，随着N-FL浓度的增加，Vmax也随之增加，说明补体系统被SARS-CoV-2 N蛋白激活。令人满意的是，当体系中加入过量的nCoV396Fab，补体的激活会被抑制，其抑制补体效果与抗体的浓度呈正相关【图5】。该实验结果在多例不同补体激活的患者血液中得以重复。

图5: mAb nCoV396抑制SARS-CoV-2 N蛋白诱导的补体过度激活

总的来说，该研究分离出了首个全人源的SARS-CoV-2 N蛋白的抗体，确定了该抗体识别N蛋白的抗原表位，通过离体的补体激活实验，确定了N蛋白在补体过度激活中的作用，同时鉴定了nCoV396能够抑制N蛋白诱导的补体过度激活的功能。为补体过度激活的重症COVID-19患者提供了新的候选治疗方案的理论基础。

中山大学附属第五医院博士后康斯斯，博士研究生杨梅、何素华，暨南大学王月明为文章的共同第一作者。中山大学附属第五医院陈守登教授，单鸿教授，肖非教授及暨南大学生命科学技术学院廖化新教授为论文的共同通讯作者。该项工作得到了珠海市新型冠状病毒疫情防控应急研究（社会发展类）专项基金的支持。同时感谢上海同步辐射光源工作人员BL18U/19U/17U对X线衍射数据筛选和收集工作的帮助的支持。

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