Cell Reports｜蛋白质组学揭示HDAC抑制剂的全局性调控机制
景杰学术 | 报道
组蛋白乙酰化是一种常见且重要的表观遗传调控机制。组蛋白乙酰化修饰水平主要受组蛋白乙酰基转移酶（HATs）和组蛋白去乙酰化酶（HDACs）共同调控，这种动态可逆的特性也令相关蛋白质成为了理想的药物靶标。FDA已经批准了多种组蛋白去乙酰化酶抑制剂 (HDACi) 在临床上的使用，已有研究表明HDACi导致个别基因的promoter区域乙酰化水平降低，下调相关基因表达。此外，特别是对于癌细胞中高表达的基因而言，HDACi增加了染色体的开放性，并影响了enhancer的状态和染色质构象，从而影响了转录延伸。但是，目前有关HDACi对于组蛋白乙酰化修饰水平以及蛋白质表达的整体影响并没有一个很全面的了解。
近日，来自美国North Carolina大学的Ian J. Davis教授团队，在Cell子刊Cell Reports上，发表了题为“HDAC inhibition results in widespread alteration of the histone acetylation landscape and BRD4 targeting to gene bodies”的研究长文。研究人员运用定量蛋白质组学技术，全面揭示了癌细胞在HDACi处理后在基因组层面和蛋白质组层面发生的改变。结果发现HDACi会导致组蛋白H4的聚乙酰化，使得其成为含溴结构域蛋白更易结合的靶标，并且发现转录活跃的基因中的过度乙酰化可能与增加的BRD4结合有关。
一、 HDACi引起组蛋白H4的聚乙酰化，进而招募转录机器蛋白和BET家族蛋白
作者利用质谱分析经过/未经过丁酸钠（一种HDACi）处理的HeLa细胞中组蛋白H4的乙酰化水平，发现在经过HDACi处理后，组蛋白H4变得超乙酰化，有超过65%的H4含有二、三、四乙酰化。进一步的定量分析发现单乙酰化的组蛋白含量降低，含有二、三、四乙酰化的组蛋白含量均升高。作者紧接着利用没有修饰的和四乙酰化的H4来捕获分离HeLa细胞的核提取物，质谱分析发现其中富集的最多的就是BET（含有溴结构域和额外末端）家族的BRD2、BRD3、BRD4蛋白，此外还有组蛋白乙酰基转移酶家族的成员和TFIID复合物。
图一 丁酸钠导致H4超乙酰化
二、 HDACi增加基因区域的组蛋白H4的聚乙酰化
作者试图在全基因组范围内定位组蛋白乙酰化的增加,因此选择临床相关的泛HDAC抑制剂——SAHA（vorinostat）开展了进一步的研究。定量ChIP-seq技术测试了不同区域的H4乙酰化水平的改变程度，结果发现组蛋白H4乙酰化在全基因组中大量增加，尤其是在转录起始位点（TSS）周围分布更广。整个基因组中的聚乙酰化改变程度各不相同，大多数区域的乙酰化提高了4到8倍，但也有某些区域的乙酰化变化很小（<4倍变化），还有一些区域在处理后最多发生了60倍的变化。
作者根据处理前的H4乙酰化水平及处理后H4乙酰化水平发生改变的程度将整个基因组分成5个区域，其中具有低乙酰化水平且受SAHA（另一种HDACi）影响最小的Quad 1区域主要富集在远端基因间区，与此相反的，受SAHA影响最大的Quad 4区域主要富集在基因区。乙酰化水平较高但是受SAHA影响较小的Tail区实际在绝对H4乙酰化水平上发生了较大变化，这类区域主要富集在promoter区域。以上这些证据表明SAHA在整个基因组水平上不会均衡的影响各处的乙酰化水平，而是优先影响预先存在H4乙酰化的区域，特别是在基因本体中。
图二 SAHA导致HL60细胞基因本体内的乙酰化增加
三、 HDACi增加H4乙酰化招募BRD4蛋白结合进而促进基因表达
为了探究HDAC抑制和组蛋白乙酰化对含溴结构域蛋白的靶向结合的影响，作者利用BRD4蛋白对加SAHA处理和未加SAHA处理的HL60细胞的染色质进行了ChIP-seq实验，结果发现SAHA处理使得BRD4结合的位点增加了一倍。由于BRD4的蛋白含量未受SAHA的影响，因此增加的BRD4结合位点可能是BRD4蛋白的重新分布导致的。
由于SAHA处理而增加的BRD4结合位点主要富集在基因本体区域，在启动子区域则没有了。为了评估BRD4靶向是否与转录有关，作者进一步分析了BRD4结合区域与基因表达的关系，结果发现与新的BRD4结合位点相关的基因有91%被上调，相反的，与BRD4结合降低或未改变的相关基因中，有65%以上的基因是被下调的。作者还进一步比对了SAHA治疗后基因本体中BRD4结合升高的基因与治疗后基因本体中与H4乙酰化相关的基因，结果表明在基因本体中增加了BRD4信号的基因显著富集在增加了H4聚乙酰化的基因中。综上，这些数据表明HDACi通过增加H4的聚乙酰化来增加基因本体中BRD4的结合位点。
图三 SAHA处理可增强基因本体中BRD4的结合
本文中，定量蛋白基因组学数据全面展示了HDACi对基因组表观修饰及相关蛋白结合位点和下游蛋白表达量造成的影响，为揭示去乙酰化酶抑制剂的作用机制提供了更直接的证据支持。更加重要的是，这为研究其它类型的抑制剂的作用机制提供了新的思路。
2021-04-19
2020-09-02
2019-01-07
2018-08-31
2020-07-23
参考文献
1. Slaughter et al., 2021, HDAC inhibition results in widespread alteration of the histone acetylation landscape and BRD4 targeting to gene bodies. Cell Reports.