“小细胞，大学问”，Cell Reports：首次报道胸腺上皮细胞的整合组学研究

文章主要结论与亮点

1. K5D1转基因小鼠，获取免疫活性及自我耐受的T细胞

2. K5D1小鼠来源的cTECs和mTECs 蛋白组学与RNA-Seq分析

3. β5t敲除cTECs中蛋白酶体组分发生变化

1、K5D1转基因小鼠，获取免疫活性及自我耐受的T细胞

为了克服用于蛋白质组分析的胸腺上皮细胞（TECs）数量有限这一问题，研究者使用胸腺增大的K5D1转基因小鼠。角蛋白5（keratin 5）启动子可促进表皮及胸腺显著增生。重要的是，增大的胸腺仍然维持着髓皮质结构以及产生T细胞的能力，但其TEC数目大约是同龄正常小鼠的80到100倍。研究者用流式细胞仪检测等方法证实K5D1转基因小鼠胸腺细胞的数量增加，接近正常小鼠的30- 50倍，而其cTECs及mTECs标志分子的表达情况与正常小鼠相似，CD4/CD8和TCRβ/TCRδ的分布也没有明显的变化（图1A、B）。结果表明，K5D1小鼠胸腺能够产生和选择功能正常及自我耐受性T细胞，其cTECs和TECs可作为生物化学分析，包括对细胞需求量比较大的蛋白质组学分析。

图1. K5D1胸腺产生功能正常和自我耐受的T细胞

2. K5D1小鼠来源的cTECs和mTECs 蛋白组学与RNA-Seq分析

研究人员将K5D1及B6对照小鼠的胸腺消化之后，利用磁珠分选的方法分离到了用于转录组与蛋白质组学分析的cTECs和mTECs（样本策略），进行RNA-Seq与TMT标记的定量蛋白组学质谱分析（组学策略）。与高度相似的K5D1和B6小鼠来源的细胞基因表达谱不同，cTECs和mTECs之间基因表达谱存在显著差异(图2A-C)，主要为cTECs和mTECs功能独特性的相关基因，如mTECs中检测到的Aire-依赖性与-非依赖性的编码组织限制性自身抗原基因表达水平显著高于cTECs (图2 G)。

图2. cTECs及mTECs RNA测序分析

接下来，作者对K5D1小鼠分离的胸腺上皮细胞 (cTECs)和髓质胸腺上皮细胞(mTECs)进行了TMT标记的定量蛋白组学质谱分析，总共定量到5,753个蛋白。cTECs和mTECs的蛋白组表达谱也存在明显的差异。308种蛋白质在mTECs比cTECs中表达量显著增加，其中202个蛋白对应的mRNA在mTECs表达明显增高，这些蛋白主要与mTECs发育相关。232个蛋白在mTECs表达显著降低，其中199个蛋白对应的mRNA表达量也显著降低，其中包括对cTEC功能重要性的蛋白水解蛋白 (图3B)。

图3. cTECs和mTECs的蛋白质组学和联合分析

3. β5t敲除cTECs中蛋白酶体组分发生变化

在研究中作者发现，K5D1转基因小鼠胸腺的皮层区域含有β5t+cTECs和CD4/CD8双阳性胸腺细胞，β5t是胸腺蛋白酶体的cTEC特异性成分，对CD8+T细胞的最佳生成至关重要。然而，目前还不清楚β5t促进CD8+T细胞发育的具体分子机制。研究者进一步分析了β5t-缺失小鼠cTECs的转录和蛋白质表达谱。

GO分析发现，β5t的缺失导致了cTECs中蛋白酶体组分的高度特异性改变。大部分蛋白酶体成分，包括20S核心颗粒组份，与19S调节颗粒组分表达量，在β5t敲除后明显减少，相反，β5i和β5表达量上升代偿β5t缺陷以维持蛋白酶体复合物（图4B-D）。免疫印迹实验也证实了这一结果。

图4. β5t缺陷小鼠cTECs中蛋白酶体成分发生改变

综上所述，本研究利用基因改造的胸腺增大但功能正常小鼠，对cTECs和mTECs进行蛋白组学和转录组学的联合分析，鉴定到了决定cTECs和mTECs发育及功能不同的重要特征分子。结果揭示了胸腺蛋白酶体对cTECs蛋白酶体亚单位组成高度特异性影响，为进一步探索胸腺生物学的形成提供了一个整合性跨组学分析平台。

参考文献

Izumi Ohigashi, et al., 2019, Trans-omics Impact of Thymoproteasome in Cortical Thymic Epithelial Cells. Cell Reports.