Organoids
类器官
类器官(Organoids),是指利用成体干细胞(ESCs)或诱导式多能干细胞(iPSCs)进行体外三维(3D)培育的具有一定空间结构的组织类似物。类器官能高度模拟体内组织结构及功能并能够长期稳定传代培养。类器官模型是介于细胞系和动物模型之间的一种新型功能化体外模型,可用于解析遗传发育、建立疾病模型、筛选药物和检测毒性以及探索个性化医疗方案。迄今为止世界各国科学家陆续培养出脑、肝、胃、肺、肠、肾脏和胰腺等各种类器官。
结果发现,虽然抑制TP53的活性之后,HDR介导的基因敲入方式的效率略有提高,但仍然比NHEJ介导的基因编辑效率要低。Hans Clevers研究组的工作用CRISPR-HOT方法,建立了不依赖于对TP53活性抑制的以NHEJ介导的基因编辑技术,简化了基因敲入的流程,对于肝细胞等成体干细胞来源的类器官可视化研究提供了可靠的基因编辑方式。
2020年11月,Hans Clevers研究团队又在《Nature Protocols》杂志发表学术论文《Establishment of human fetal hepatocyte organoids and CRISPR–Cas9-based gene knockin and knockout in organoid cultures from human liver》,阐述利用CRISPR/Cas9基因编辑技术探究人类胎儿肝细胞作为类器官长期扩增的培养条件。
在文章中,作者提出:针对人类胎儿肝细胞和人类肝导管类器官的基因组编辑需要两种不同的实验程序。对于人类胎儿肝细胞类器官,采用基于电转杯电转染的转染策略。为此,类器官必须分解成单细胞或小块细胞,建议从第5代及以后开始对肝细胞类器官进行基因组工程设计,肝细胞类器官电穿孔的能力通常不会随时间而降低,作者已经成功地对人胎儿肝细胞类器官进行了基因组工程,可以做到至少第50代为止。
图示:人类胎儿肝细胞类器官的基因组工程技术概略图
(采用电转杯电转染)
另外针对不同的基因编辑方式(Knock in和Knock out),作者也分享了非常详细的应对策略(见下图)。
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参考文献:
1、Benedetta Artegiani, Delilah Hendriks, Joep Beumer, Rutger Kok, Xuan Zheng, Indi Joore, Susana Chuva de Sousa Lopes, Jeroen van Zon, Sander Tans, Hans Clevers
Fast and Efficient Generation of Knock-In Human Organoids Using Homology-Independent CRISPR-Cas9 Precision Genome Editing
Nat Cell Biol 2020 Mar 2[Online ahead of print]
2、Delilah Hendriks, Benedetta Artegiani, Huili Hu, Susana Chuva de Sousa Lopes, Hans Clevers
Establishment of human fetal hepatocyte organoids and CRISPR-Cas9-based gene knockin and knockout in organoid cultures from human liver
Nat Protoc. 2020 Nov 27