用于人类移植的器官的有限供应是严重的未满足的医疗需求。由于其相似的器官大小和生理特性,长期以来人们一直认为猪是人类移植的器官,组织和细胞的有希望的来源。然而,尽管多年来进行了许多尝试,但从猪到人的移植受到两个主要的阻碍:1)猪内源性逆转录病毒(PERV)跨物种传播的风险; 2)猪移植物和人类受体之间的分子不相容性。
杨璐菡
PERV可以在体外感染人细胞,在细胞之间繁殖,并重组以适应人宿主,这可能引起人畜共患共患病。PERV整合到人类基因组中可能会导致免疫缺陷和肿瘤发生。由于PERV序列是猪基因组的一部分,因此无法像其他人畜共患病原体一样通过生物安全育种消除。 已经证明,通过使用CRISPR靶向重复元件(以下简称“ PERVKO”)并成功生产不含PERV的猪,可以证明PERV元件的全部25个拷贝的全基因组灭活,消除了病毒传播的潜在风险。
临床异种移植的另一个障碍是由于猪器官和人类免疫系统之间的分子不相容性导致的器官排斥。特别是,某些聚糖表位,主要是α-Gal(半乳糖-α-1,3-半乳糖),Neu5Gc(N-糖基神经氨酸)和SDa表位,是猪所特有的,预先形成的抗体的结合可通过以下方式引发超急性移植排斥: 补体级联的激活。 GGTA1(α-1,3-半乳糖基转移酶),CMAH(胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶)和B4GALNT2(β-1,4-N-乙酰-半乳糖胺基转移酶2)的遗传失活可去除α-Gal,Neu5Gc和 SDa表位,已显示可减弱这种快速的移植排斥反应。
两个5天大的PERVKO·3KO·9TG仔猪的图像
此外,人类补体调节蛋白的过表达,包括CD46(膜辅因子蛋白),CD55(衰变促进因子)和CD59(MAC抑制蛋白),可进一步减少超急性排斥反应并延长移植物存活时间。 除了体液损伤和超急性反应外,对异种移植物的急性细胞反应,包括自然杀伤(NK)细胞和巨噬细胞的浸润,都有助于异种移植排斥。已经证明人B2M-HLA-E融合蛋白在猪内皮细胞中的表达通过抑制性信号传导降低了NK介导的细胞毒性,而人CD47的表达通过CD47与SIRPα的相互作用降低了巨噬细胞介导的毒性。
另外,猪与人凝血系统之间的不相容性也可能导致血栓性微血管病和全身性消耗性凝血病,这在许多异种移植的临床前实验中均已观察到。特别是,猪TFPI(组织因子途径抑制剂)不能有效抑制人因子Xa和VIIa / TF(组织因子)复合物以防止凝血酶形成。同样,猪血栓调节蛋白(THBD)无法与人凝血酶结合以激活抗血栓形成蛋白C以防止血凝块形成。除此之外,猪CD39在内皮细胞活化后会失活,其表达不足以抑制人血小板聚集。为了解决这些不兼容问题,已经测试了几种针对凝血途径的遗传修饰,并成功恢复了凝血相容性。
迄今为止,已尝试对猪进行单独或组合的40多种遗传修饰,以减轻与不相容性有关的超急性排斥,延迟异种移植排斥和急性细胞排斥。已经创建了具有三联敲除GGTA1,CMAH和B4GALNT2(以下称为“ 3KO”)的猪,与具有单联敲除GGTA1或双敲除GGTA1和CMAH的猪相比,它们的10个外周血单核细胞显示出最小的异种反应性抗体结合。此外,已经测试了多种人类转基因,其中一些在临床前模型中显示出有益的结果。令人鼓舞的是,最近的一项研究表明,从猪身上携带GGTA1基因敲除,hCD46和hTHBD过表达的心脏异种移植可以在狒狒中维持生命6个月。另一项研究表明,恒河猴存活了400多天,肾脏中携带有GGTA1敲除和hCD55过表达的肾脏异种移植物。此外,使用来自携带GGTA1基因敲除的猪的胰岛,将猪胰岛细胞异种移植到非人灵长类动物(NHP)糖尿病中显示出显著提高的植入率。这些研究支持使用基因工程异种移植器官可以实现长期移植存活。
尽管付出了多年的努力,但尚未设计出具有消除PERV,提高免疫学和凝血相容性等综合功能的猪器官,这对于临床应用是理想的。在这项研究中,研究人员试图使用不同的基因组修饰工具和克隆技术来创建可临床使用的猪器官。
具体而言,在这项研究中,研究人员提高了猪生殖细胞编辑的规模,从使用CRISPR靶向单个重复基因座到使用多种基因组工程方法工程化18个不同基因座。研究人员使用CRISPR-Cas9和转座子在42个等位基因上对猪基因组进行了工程改造,并生产了带有PERV灭活,异种抗原KO和9种有效人类转基因的PERVKO.3KO.9TG猪。体外试验表明,这些猪对人的体液和细胞介导的损伤以及凝血功能异常具有明显的抵抗力,与同种异体移植相似。成功创建PERVKO.3KO.9TG猪代表了向安全有效的猪异种移植迈出的重要一步,这也代表了在生物体内工程新功能的合成生物学成就。
参考消息:
https://www.sciencemag.org/news/2019/12/eyeing-organs-human-transplants-companies-unveil-most-extensively-gene-edited-pigs-yet
https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2019.12.17.876862v1
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