NEJM：心肌炎无创检测获重大突破！科学家发现外周血中用于检测心肌炎的miRNA，可鉴别心梗引起的心肌损伤丨科学大发现
相信大家在新冠肺炎疫情全球流行期间，一定听过一种很致命的并发症——暴发性心肌炎。
心肌炎是心脏的炎症性疾病，其病因包括病原体感染、毒素、药物及自身免疫功能障碍，最终可能引起心脏性猝死或进展为扩张型心肌病[1]。
然而，当前心肌炎的诊断仍较为困难，常常需要建立在排除冠心病的基础上，且难以与冠状动脉非阻塞型心肌梗死（MINOCA）鉴别[2]。
临床上，心脏MRI和心内膜心肌活检（EMB）是诊断心肌炎最重要的两大手段。然而，这两种检测手段各有其局限性。心脏MRI并非在所有医疗场所可以进行，且MRI提示心肌水肿的敏感性随时间降低[3]；而EMB作为有创检查，仅用于病情危重、治疗反应差、病因不明的患者[4]。因此，寻找敏感性和特异性高、无创或微创的心肌炎检测手段十分必要。
近期，西班牙国家心血管研究中心（CNIC）的Pilar Martín研究团队，在心肌炎检测手段取得重要成果，并将其发表在《新英格兰医学杂志》上[5]。
研究人员通过miRNA微阵列分析等技术，筛选出一种在外周血中检测心肌炎的miRNA（hsa-miR-Chr8:96），并且该miRNA能用于鉴别心肌梗死引起的心肌损伤，该研究有望为心肌炎诊断提供新的检测手段。
论文首页截图
近年来，越来越多证据表明miRNA可作为心血管疾病的新型的分子标志物。此外，在心肌损伤中（如心肌炎和心肌梗死），外周血液中T细胞表型发生改变。尤其是Th17细胞，在病毒性心肌炎的抗心肌抗体产生过程中发挥重要作用，从而调控心肌炎和扩张型心肌病的发生。
基于上述研究基础，那么能否在外周血中筛选出一种Th17细胞合成的miRNA用于心肌炎检测呢？
研究人员首先构建实验性自身免疫性心肌炎和心梗的小鼠模型，进一步验证Th17细胞在心肌炎和心梗中的作用。
通过检测不同时间的心肌损伤标志物和左心室射血分数（LVEF），研究人员发现自身免疫性心肌炎和心梗小鼠心肌损伤达到峰值时间分别为21天和3天左右。
通过荧光活化细胞分选（FACS），研究人员发现心肌炎和心梗后小鼠Th17细胞升高均在14天达到顶峰，然而Th17细胞在心肌炎的急性期（21天）仍然有明显升高，而在心梗急性期（3天）没有明显变化。
同时，研究人员也检测心肌炎和心梗患者的Th17细胞反应。结果显示，仅急性心肌炎血液中有显著的Th17细胞升高，而STEMI和NSTEMI患者均无明显变化。
Th17细胞在心肌炎和心梗的变化
为了进一步筛选出Th17细胞特异性合成的miRNA，研究人员从自身免疫性心肌炎小鼠的外周血中获得不同T细胞亚群，包括CD4+ T细胞、多克隆Th17细胞、卵清蛋白抗原特异性刺激培养的Th17细胞（Th17ag-sp）和Th17ag-sp分选细胞，进行miRNA微阵列分析，共筛选出27种同时在Th17ag-sp培养和分选的细胞中高表达的miRNA。
基于分选CD69敲除（引起重度心肌炎）和野生型（仅引起轻中度心肌炎）小鼠的Th17ag-sp细胞，miRNA分析筛选出在前者升高最显著的两种miRNA：mmu-miR-721和mmu-miR-483-5p。而qPCR结果表明只有mmu-miR-721为Th17ag-sp细胞特异合成。
同时，与心梗小鼠的miRNA筛选结果相比，mmu-miR-721和mmu-miR-483-5p也在自身免疫性心肌炎中高表达，qPCR分析证实了上述结果。
心肌炎和心梗小鼠miRNA表达情况。通过miRNA微阵列分析和qPCR，mmu-miR-721为小鼠自身免疫性心肌炎Th17ag-sp特异性合成，并可与心梗鉴别
通过检测小鼠外周血中mmu-miR-721表达，研究人员发现无论是自身免疫性心肌炎还是病毒性心肌炎，其表达均较空白对照组和心梗组显著增高，且mmu-miR-721在心肌炎表达量随时间变化与Th17细胞一致。
心肌炎外周血mmu-miR-721表达增高
为了验证mmu-miR-721的人类同源基因产物在心肌炎中的作用，研究人员用小鼠mmu-miR-721的探针来检测心肌炎患者的扩增产量，结果显示，心肌炎患者的血浆克隆效率高于健康人群及心梗患者。
通过扩增产物测序，研究人员发现有长度为18个核苷酸的序列与小鼠mmu-miR-721相同，且在哺乳动物中进化高度保守，该18nt序列位于人类基因组中的8号染色体（基因序列编号NC_018919.2），研究人员证实该18nt序列加上5’端的3个核苷酸（TCT）构成mmu-miR-721的人类同系物(TCTTGCAATTAAAAGGGGGAA)，命名为hsa-miR-Chr8:96。
人类血清标本克隆效率
接下来，研究人员验证hsa-miR-Chr8:96在心肌炎患者中的检测作用。结果表明，与健康对照和心梗患者相比，该新型miRNA在血浆中含量更高。qPCR检测各种T细胞亚群的hsa-miR-Chr8:96表达，表明该miRNA主要由Th17细胞合成。
为了检验该miRNA在心肌炎中的诊断价值，研究人员绘制ROC曲线，并发现与健康对照和心梗患者相比，其ROC曲线下面积分别为0.988和0.927，这表明hsa-miR-Chr8:96对心肌炎患者有较高诊断准确性。
此外，在矫正年龄、性别、射血分数、血清肌钙蛋白水平后，这种新型的miRNA在区分心肌炎和心梗上仍有显著差异。
hsa-miR-Chr8:96用于急性心肌炎患者的检测价值
综合上述结果，本研究主要筛选出一种新型的miRNA（mmu-miR-721），该miRNA可作为小鼠心肌炎检测的分子标志物，并且其人类同源miRNA（has-miR-Chr8:96）也在心肌炎患者有较大诊断价值，且可用于鉴别心肌梗死。
以往的研究表明，在心肌炎或心衰中miRNA表达发生改变，可能作为心肌损伤的检测手段[6-8]，但这些研究并未筛选出可用于鉴别不同病因引起心肌损伤的miRNA，而本研究筛选出的hsa-miR-Chr8:96可用于鉴别心肌炎和心肌梗死引起的心肌损伤。
需要指出的是，虽然该研究表明，相比健康人群和心梗患者，心肌炎患者外周血中hsa-miR-Chr8:96表达增高，但该miRNA在临床上能否作为心肌炎的诊断工具仍然需要更多的研究。
hsa-miR-Chr8:96在其他心血管疾病中（如扩张型心肌病）的表达水平尚未研究。此外，在该研究中，不同心肌炎患者的hsa-miR-Chr8:96表达量有较大异质性，因此能否通过外周hsa-miR-Chr8:96含量反映心肌炎严重程度也值得进一步研究。
总之，该研究筛选出一种外周血中检测心肌炎的miRNA，并可鉴别心肌梗死，该miRNA有望成为临床上心肌炎患者的新型检测标志物。
参考文献：
1. Felker GM, Thompson RE, Hare JM, et al. Underlying causes and long-term survival in patients with initially unexplained cardiomyopathy. N Engl J Med. 2000;342(15):1077-1084. doi:10.1056/NEJM200004133421502
2. Thygesen K, Alpert JS, Jaffe AS, et al. Fourth Universal Definition of Myocardial Infarction (2018). J Am Coll Cardiol. 2018;72(18):2231-2264. doi:10.1016/j.jacc.2018.08.1038
3. Ferreira VM, Schulz-Menger J, Holmvang G, et al. Cardiovascular Magnetic Resonance in Nonischemic Myocardial Inflammation: Expert Recommendations. J Am Coll Cardiol. 2018;72(24):3158-3176. doi:10.1016/j.jacc.2018.09.072
4. Heymans S, Eriksson U, Lehtonen J, Cooper LT Jr. The Quest for New Approaches in Myocarditis and Inflammatory Cardiomyopathy. J Am Coll Cardiol. 2016;68(21):2348-2364. doi:10.1016/j.jacc.2016.09.937
5. Blanco-Domínguez R, Sánchez-Díaz R, de la Fuente H, et al. A Novel Circulating MicroRNA for the Detection of Acute Myocarditis. N Engl J Med. 2021;384(21):2014-2027. doi:10.1056/NEJMoa2003608
6. Corsten MF, Papageorgiou A, Verhesen W, et al. MicroRNA profiling identifies microRNA-155 as an adverse mediator of cardiac injury and dysfunction during acute viral myocarditis. Circ Res. 2012;111(4):415-425. doi:10.1161/CIRCRESAHA.112.267443
7. Aleshcheva G, Pietsch H, Escher F, Schultheiss HP. MicroRNA profiling as a novel diagnostic tool for identification of patients with inflammatory and/or virally induced cardiomyopathies. ESC Heart Fail. 2021;8(1):408-422. doi:10.1002/ehf2.13090
8. Zhang J, Xing Q, Zhou X, et al. Circulating miRNA‑21 is a promising biomarker for heart failure. Mol Med Rep. 2017;16(5):7766-7774. doi:10.3892/mmr.2017.7575
责任编辑丨BioTalker