中科院南京土壤研究所李光杰研究组揭示WRKY46转录因子增强拟南芥铵毒耐受性的分子机制

2021年6月15日，New Phytologist在线发表了中国科学院南京土壤研究所/土壤与农业可持续发展国家重点实验室李光杰副研究员团队完成的题为“WRKY46 promotes ammonium tolerance in Arabidopsis by repressing NUDX9 and IAA-conjugating genes and by inhibiting NH4+ efflux in the root elongation zone”的研究论文。该研究发现拟南芥WRKY46转录因子通过整合调控蛋白N-糖基化和游离型IAA含量来抑制根伸长区NH4+的外流，以增强对铵毒的耐受性。

研究背景

铵（NH4+）是植物吸收利用无机氮的主要形式之一，但是当NH4+浓度达到中等水平即会对大多数植物的根系生长产生毒害作用，最显著的症状为初生根（PR）的生长受抑制。实验室之前研究发现NH4+主要通过影响拟南芥根系伸长区（EZ）来抑制PR生长，而这与NH4+外流的升高有关，但尚不清楚其潜在的生理和分子变化过程。另外，转录调控是植物应对NH4+毒性的最重要机制之一，但对于转录因子如何参与该调控的具体分子机制仍有待研究。

主要结果

1.WRKY46参与拟南芥根的高NH4+响应

为研究NH4+抑制PR生长的转录调控机制，分别利用NH4+处理和非处理的拟南芥根系为材料进行RNA-seq检测和分析，结果发现WRKY46对NH4+响应最灵敏，诱导表达水平明显高于其他WRKY转录因子。pWRKY46::GUS表达显示，高NH4+诱导根中，尤其是根尖部位WRKY46的上调。敲除及过表达株系表型分析表明，WRKY46主要在根EZ部位发挥功能，并正调控高NH4+条件下的PR生长。

2.WRKY46通过蛋白质N-糖基化来稳定NUDX9以抑制NH4+外流

已有研究表明伸长区NH4+通量的增加是与NH4+胁迫下PR生长抑制相关的关键特征之一。为检测WRKY46对高NH4+条件下PR生长的促进是否与NH4+通量调节有关，对不同遗传材料根系分生区（MZ）和EZ的NH4+净通量进行检测，结果发现WRKY46负调控EZ NH4+的外流。

已知GDP-甘露糖焦磷酸化酶（NUDX9）通过调节蛋白N-糖基化而参与高NH4+下的PR生长。本研究通过ChIP-qPCR、Y1H及LUC活性检测发现，WRKY46直接与NUDX9启动子结合并负调控该基因的转录。随后对不同遗传材料根的NH4+通量进行检测以分析WRKY46调控的NH4+外流是否是通过NUDX9依赖的N-糖基化，结果表明NUDX9作用于WRKY46下游并参与WRKY46依赖的高NH4+响应，但该过程还包含其他下游靶基因的参与。

3.游离IAA参与EZ部位WRKY46介导的NH4+外流抑制

研究显示，高NH4+下的PR生长抑制与生长素吲哚-3-乙酸（IAA）有关联，且WRKY46参与调控渗透/盐胁迫下根中IAA的含量。通过pDR5::GUS检测发现，WRKY46表达差异所导致的NH4+敏感性差异与游离IAA含量有关。进一步实验结果显示，WRKY46直接与IAA结合基因（GH3.1、GH3.6、UGT75D1、UGT84B2）的启动子结合并抑制它们的转录（图1），从而正调控游离IAA含量以抑制EZ NH4+外流。此外，进一步通过IAA外源处理检测发现，蛋白N-糖基化抑制的NH4+外流部分依赖于IAA含量。

图1. WRKY46对高NH4+胁迫下PR生长的调控与IAA含量相关

一图解文

在高NH4+条件下，NH4+可诱导拟南芥中WRKY46转录因子的表达。随后，WRKY46直接与GH3.1、GH3.6、UGT75D1和UGT84B2基因启动子结合并抑制它们的表达，从而维持游离态IAA含量和初生根的生长。与此同时，WRKY46通过抑制NUDX9转录以稳定蛋白质N-糖基化水平，由此IAA生物合成酶在N-糖基化后保持稳定，IAA在高NH4+条件下的生物合成也随之增加。升高的游离IAA可诱导IAA结合基因的转录，而这与WRKY46的转录抑制间接相关。总之，WRKY46通过抑制IAA结合和蛋白质N-糖基化来维持IAA稳态，是培育高NH4+耐受作物品种的宝贵遗传资源。

图2.WRKY46在高NH4+胁迫下的工作模型