Nature：CRISPR筛选发现关键基因，让抗肿瘤T细胞疗法更强大、更持久

原创 nagashi 生物世界

免疫疗法方兴未艾，并在肿瘤治疗中展现出极佳的治疗效果，而抗肿瘤T细胞疗法是免疫疗法的重要代表。

细胞毒性CD8 T细胞可以直接杀死肿瘤细胞，是在临床使用的许多免疫治疗方法中动员的关键武器。然而，肿瘤组织能够创造严酷的微环境，招募免疫调节细胞，并诱导抑制T细胞功能的信号分子的产生，从而阻碍了T细胞的功能、聚集和肿瘤浸润。

这些研究表明抗肿瘤T细胞疗法的疗效会因为肿瘤组织的抵抗性反应而逐渐衰弱，那么，我们该如何去规避这一现象的发生呢？

2019年12月11日，美国田纳西州孟菲斯圣犹达儿童研究医院迟洪波团队在 Nature 杂志上发表了题为：Targeting REGNASE-1 programs long-lived effector T cells for cancer therapy（以REGNASE-1为靶点的重编程长寿命效应T细胞用于癌症治疗）的研究论文。

论文研究发现，REGNASE-1蛋白的缺失延长了抗肿瘤CD8 T细胞的存活，增强了它们的功能，使T细胞能够更好地、更有效地与癌症作斗争。

免疫细胞抗肿瘤疗法深刻地改善了对某些恶性肿瘤的治疗，最常见的便是过继性T细胞治疗(ACT)。这种方法依赖于从人的血液或肿瘤中取出的T细胞，在实验室进行刺激以诱导分裂分化甚至修改细胞表面受体，使其转化为抗肿瘤T细胞，再回输到病人体内，从而杀伤患者体内的肿瘤细胞。例如，CAR-T疗法，在T细胞上表达一种专门针对肿瘤细胞的受体——嵌合抗原受体(CAR-T)，这一疗法在治疗白血病等血液肿瘤上是非常成功的。

尽管免疫细胞疗法具有巨大的潜力，但目前ACT的治疗效用是有限的，因为回输到患者体内的改良T细胞往往仅能短暂存在，而且常常无法克服肿瘤组织的抵抗性作用。正常情况下，机体内抵抗了病原体或肿瘤细胞后，会留下一类被称为记忆T细胞长寿命细胞，它们是自我更新的，如果再次遇到相同的感染或恶性肿瘤，它们可以迅速增殖产生大量的细胞毒性CD8 T细胞。然而，如果不能消除感染或肿瘤，细胞毒性T细胞将逐渐失去其功能（称为exhaustion的过程）。

用于ACT的理想T细胞群能够浸润肿瘤并大量积累，同时保留细胞毒性功能和自我更新能力。但T细胞分化为细胞毒性CD8T细胞损害了成功保留了形成长期记忆细胞的潜力。研究者于是提出了这样一个问题：是否有一种策略可以在ACT的T细胞中诱导出这两种有益的性状。

研究表明，在复杂的肿瘤微环境中，CD8 T细胞需要有强烈的新陈代谢，以维持生存所需的营养和能量需求，从而保持其抗肿瘤活性。

于是该团队等利用CRISPR/Cas9文库筛选技术敲除了3000多个与T细胞代谢相关的基因，在小鼠抗肿瘤ACT模型中对这些基因的功能进行了检测。研究团队鉴定了200多个基因，这些基因可以显著影响转移到荷瘤小鼠体内的CD8 T细胞的持久性和功能。许多基因的破坏会对细胞的存活能力产生负面影响，从而在肿瘤中积累，但有4个基因的破坏会导致更多的T细胞浸润肿瘤组织。

这4个基因中作用最显著的是编码REGNASE-1酶的基因，该酶与RNA结合并降解RNA，从而影响免疫应答，但其在CD8 T细胞抗肿瘤作用中的作用尚未见报道。REGNASE-1缺失的CD8 T细胞在肿瘤组织中的积累量是正常CD8 T细胞的2000倍。缺乏REGNASE-1的CD8 T细胞比野生型CD8 T细胞能更好地对抗两种肿瘤——黑色素瘤和急性淋巴细胞白血病。

为了更好地理解REGNASE-1缺失导致T细胞在肿瘤组织中持续性增加的原因，作者分析了REGNASE-1缺陷型细胞和野生型细胞的基因表达谱。REGNASE-1的缺失与记忆T细胞分子特征的增加有关，表明存在比正常群体更大的长寿命记忆样细胞，这些细胞可快速增殖产生细胞毒性CD8 T细胞。

Regase-1缺失的CD8T细胞表现为线粒体功能显著增加(线粒体是提供细胞能量的关键来源的细胞器)，包括产生能量和消耗氧气的能力。这是十分值得注意的，因为这种能力在抗肿瘤T细胞中经常受到损害。

REGNASE-1缺陷的这些联合效应若能应用于ACT的CD8 T细胞和CAR-T细胞，那么便能使ACT免疫疗法产生质的飞跃——重编程T细胞在靶向的癌症中积累并随时间保持活性。

为了进一步了解这一机制，研究团队使用CRISPR/Cas9敲除文库来破坏REGNASE-1缺陷的CD8 T细胞中的大约20000个基因，以查明介导REGNASE-1依赖性细胞重编程的关键下游基因。

转录因子BATF是CD8 T细胞分化的关键调控因子，它的失活使缺乏REGNASE-1的T细胞的长寿命和与线粒体相关的高表达基因不复存在。作者发现，REGNASE-1与PTPN2或SOCS1两种蛋白的联合缺失具有协同效应，与仅缺失REGNASE-1的T细胞的特性相比，更能增加T细胞的持久性、积累量和抗肿瘤活性。

研究团队报道了REGNASE-1缺失的肿瘤记忆样细胞和细胞毒性CD8 T细胞中，其细胞毒性蛋白的表达均高于野生型CD8 T细胞。具有记忆性质的野生型细胞一般不会直接杀死肿瘤细胞，而REGNASE-1缺失记忆样T细胞是否仅具有自我更新和增殖产生细胞毒性CD8-T细胞群的功能，或是否也能直接介导肿瘤细胞杀伤尚不清楚。

如果REGNASE-1缺失的记忆样T细胞拥有杀伤肿瘤细胞的能力，那么它又是如何保持自身活性的呢？更有趣的是，研究者表示，REGNASE-1缺失的CD8 T细胞需要遇到特异性识别的肿瘤抗原才能持续保持活性。这可能解释了为什么抗肿瘤T细胞相比于富含T细胞难以接触到肿瘤抗原的脾脏组织，更显著地在小鼠肿瘤组织中的聚集。

肿瘤微环境中的其他因素是否有助于增强REGNASE-1缺失CD8 T细胞的持久性仍有待研究。为此，对REGNASE-1、PTPN2、SOCS1和BATF组合性缺失的CD8 T细胞的代谢特征进行评估可能具有极好的参考价值。

这将有助于我们了解这些蛋白对CD8T细胞代谢重编程的影响，以及这对细胞分化和抗肿瘤功能的重要性。此外，在这种情况下找到相关的代谢物可能会为这些CD8 T细胞如何受到营养缺失的肿瘤微环境的影响提供线索。

这项研究为ACT免疫疗法的发展提供了重要的理论依据。十分值得去尝试在CAR-T细胞的制造过程中，利用CD8 T细胞来删除或表达低水平的REGNASE-1基因，并观察其可行性。

最后，鉴于肿瘤细胞中PTPN2的抑制使其对免疫治疗更具敏感性，那么我们是否可以在ACT免疫疗法中以REGNASE-1 CD8 T细胞和PTPN2抑制剂进行联合治疗，从而使肿瘤免疫治疗的疗效更强大、更持久。

论文链接：

https://doi.org/10.1038/s41586-019-1821-z

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