【学术前沿】OPINION|在基因表达差异的前提下定义细胞的身份

识别定义细胞身份的基因是表征细胞类型和细胞状态以及预测细胞命运选择的必要步骤。到目前为止，这项任务最广泛使用的方法是基于基因的差异表达(DE)，平均表达的变化被用作识别特定于细胞类型和状态的基因转录本的主要统计数据。虽然基于DE的方法对于确定区分细胞类型的基因是有用的，但它们依赖于测量平均表达的差异可能不能反映细胞身份基因的生物学属性。2021年5月1日, 澳大利亚悉尼大学（The University of Sydney）与儿童医学研究所（Children’s Medical Research Institute）的计算系统生物学研究组杨鹏翼(Pengyi Yang)教授在Cell Regeneration上发表论文，他们强调了对非DE方法的探索，并概述了这些方法及其在识别定义细胞身份和功能的基因方面的应用。

定义细胞的身份是细胞生物学研究的基础。传统上，细胞的组织学和形态学评估，加上免疫组织化学信息，使我们能够识别细胞类型。利用FACS分选出特定细胞类群和随后的测量这个细胞群体中每一个基因的平均表达水平 (Bulk RNA-seq), 进一步揭示了感兴趣的细胞群体的整体分子特征。然而，这些方法局限于具有已知标记基因的细胞类型，而Bulk RNA-seq掩盖了潜在的细胞异质性。最近在全基因组单细胞分析方面的技术进步使对细胞身份的探索成为可能，允许在单细胞分辨率下发现已知和未知细胞类型。然而，随着单细胞组学数据的广度和深度的不断扩大，为了解细胞身份的复杂性和细微差别提供了前所未有的视角，推测细胞身份已成为一个新的挑战。

对于某些细胞类型，仅根据组学特征来推断细胞身份的计算任务可能相对简单，需要评估已知标记基因的表达。对于罕见或以前未知的细胞类型，在没有任何先验知识的情况下，定义唯一识别该细胞的基因集是一个挑战。这就提出了一个重要的问题: 我们如何选择标记细胞身份的基因 (cell identity genes, CIGs)。

目前已有多种检测CIGs的方法，其中最常用的方法是基于基因差异表达(DE)的方法。目前已经开发了许多工具用于对大量RNA-seq数据进行DE分析，如DESeq2、edgeR和Limma，其中许多工具已成功应用于单细胞数据。最近设计的挖掘单细胞基因表达数据的方法解决了scRNA-seq数据分析的一些混淆方面，如细胞检测率变化引起的技术噪声，并试图捕捉细胞间异质性的更细微差异。然而，这些方法是否能忠实地捕获CIGs仍然是未知的。

目前大多数DE方法的一个共同特点是它们依赖于特定的基因表达模型，这忽视了细胞间基因表达的异质性，通过限制所选基因的分布来限制CIGs的发现。基于T检验的方法和MAST假设基因表达呈高斯分布;泊松分布;泊松分布和负二项分布SCDE。DE方法是基于学生的学习任务他们优先考虑基因稳定表达(即符合高斯分布)感兴趣的细胞类型和其他细胞类型,只要意思表达的变化。这意味着任何基因不遵循这个分布，就会被排除掉，而不管是否这个基因是否是CIGs,这意味着许多标记基因被DE方法只是更感兴趣的细胞类型中高度表达。

图示来自单细胞RNA-seq数据(scRNA-seq)的一种感兴趣的细胞类型的差异分布基因表达。假设的scRNA-seq数据由三种细胞类型组成，可以在低维空间中可视化为不同的簇(左)。两种差异分析方法鉴定出的基因典型表达模式:差异分布(上)和传统差异表达(下)

最近，基于新的统计指标的方法得到了发展。这些方法摆脱了以手段转换为基础的基因检测，并试图捕捉基因表达的更细微的差异。例如，scDD是一种检测差异比例(DP)、差异模态(DM)、双峰分布(BD)以及DE的综合方法。非参数方法比较少见，采用无模型方法来发现差异基因。这些指标对差异分布(DD)的基因进行了优先排序，而对差异表达的基因则进行了优先排序(图1)。虽然这些方法在确定细胞身份时对基因的优先排序方面还有待审查，它们为研究人员提供了新的途径，不仅可以发现细胞中表达最独特的基因，还可以发现可能与细胞身份及其表现型更相关的基因。

准确捕捉细胞属性的生物学解读不仅能增强我们分配细胞身份的能力，还能为研究复杂系统提供更多的可能性，在这些复杂系统中，分配细胞身份本身就更具挑战性。首先，一套全面的细胞识别读出包括广泛的细胞类型将使数据驱动的方法能够准确预测和定量调查新的细胞类型。这种计算方法将不局限于分析新的细胞类型，但可以用于分析细胞状态如何受到疾病或干预的影响，捕捉组学中会影响细胞整体表型的细微变化。其次，分配离散细胞状态的细胞身份，虽然非常重要，但只提供了一个更大的目标，即绘制所有细胞状态的部分答案。细胞在不同的细胞状态或细胞类型之间动态地转换，正如Waddington的模型所描述的，这种发育景观说明了一个细胞可能处于的状态的频谱。识别定义这些移行细胞状态的CIGs将有助于我们对细胞身份特征和谱系分化进行更深入的分析。

总之，随着单细胞技术的快速发展，新计算方法的发展，准确捕获与细胞身份最相关的CIGs，对推进我们对细胞身份的知识至关重要。CIGs的选择对一系列下游单细胞计算应用具有重要意义，通常生物学解释取决于这些下游分析的结果。希望通过提高我们识别CIGs的能力，为阐明细胞身份的因素和实现单细胞分析技术的潜力，以确定与细胞表型相关的功能属性，做出贡献并促进新的研究。

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