陈学思院士团队Bioactive Materials：基因治疗帮助纳米疫苗实现强效肿瘤免疫疗法

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肿瘤疫苗能够激活病人自身的免疫系统，以实现对肿瘤的清除或者控制其生长，是一种肿瘤免疫治疗策略。目前的蛋白质/多肽肿瘤疫苗存在着以下一些问题：一是这类疫苗容易被人体清除，限制了其抗原交叉呈递能力，同时低免疫原性也使得疫苗无法促使人体产生持续强大的T细胞免疫反应；二是肿瘤免疫耐受性的微环境也可以减弱疫苗的抗癌免疫反应。因此，需要发展更高效的策略以提高肿瘤疫苗的免疫响应性能。

针对上述问题，尽管人们开发了纳米疫苗（蛋白质/多肽抗原的纳米结晶化）以防止抗原的体内降解、提高疫苗在抗原呈递细胞中的递送效率，但是由于肿瘤组织中存在着免疫抑制性机制，基于肿瘤纳米疫苗的免疫疗法依然无法高效发挥治疗效力。因此，开发高效纳米载体以诱导特异性的胞内免疫反应目前来看仍然是长期的挑战。

在本研究中，中科院长春应化所陈学思院士团队的田华雨研究员等人通过将糖基化纳米疫苗和基因调节（gene regulated）PD-L1抑制剂相结合，开发了一种强大的肿瘤免疫治疗策略。研究设计制备了甘露糖改性的纳米疫苗载体，通过共装载抗原卵清蛋白（OVA）和胞嘧啶-磷酸盐-鸟嘌呤基序（CpG），可在树突细胞中实现内吞、成熟和交叉呈递。进一步结合基因调节PD-L1抑制剂，该纳米疫苗展现出了显著的肿瘤抑制能力，为提高免疫疗法效力提供了协同治疗思路。相关工作以“Combining mannose receptor mediated nanovaccines and gene regulated PD-L1 blockade for boosting cancer immunotherapy”为题发表在Bioactive Materials。

一、纳米疫苗的制备

在这项工作中，研究人员首先利用缩聚反应构建了接枝了精氨酸基团的聚赖氨酸（PLL-RT）。为了提高免疫应答能力，研究人员进一步将具有树突细胞特异性靶向能力的甘露糖分子共价连接到PLL-RT上形成Man-PLL-RT。紧接着，带正电的Man-PLL-RT和带负电的抗原OVA以及CpG激动剂通过静电相互作用形成纳米疫苗Man-PLL-RT/OVA/CpG（图1A）。表征显示，这一纳米疫苗的表面电势为17.8 mV，平均粒径为80.1 nm，展现出了对抗原和激动剂的高效装载能力（图1B）。

图1 Man-PLL-RT/OVA/CpG纳米疫苗的合成和基本表征

二、纳米疫苗的胞内吸收和对树突细胞的活化表征

成功制备Man-PLL-RT/OVA/CpG纳米疫苗后，作者研究了其在骨髓源性树突细胞（BMDCs）中的胞内吸收和激活能力。如图2A-2C所示，当引入了甘露糖靶向配体后，抗原和激动剂在树突细胞胞内的递送效率显著增加，表明甘露糖受体介导的胞内吸收可极大提升纳米疫苗的内化作用。高效的细胞内吞对于树突细胞的活化来说是非常重要的，因此研究利用流式细胞技术测定了纳米疫苗活化树突细胞的能力。在与纳米疫苗共孵育24小时后，纳米疫苗展现出了对成熟BMDCs表面标志物CD86表达的上调能力，这说明纳米疫苗能够最优地活化BMDCs（图2D）。细胞因子检测也佐证了纳米疫苗能够最高效地活化BMDCs，同时这些结构也证明了该纳米疫苗是通过MHC Ⅰ通路进行细胞活化（图2E-2G）。

图2 纳米疫苗对BMDCs的激活和胞内摄取

三、基因疗法递送系统的构建

为了实现基因治疗的目的，作者还构建同样基于PLL-RT的基因递送系统。作者合成了PLL-RT/pDNA复合物，再通过引入透明质酸（HA）形成HA/PLL-RT/pDNA纳米颗粒，不仅屏蔽复合物的正电荷，也能够提高递送系统对肿瘤组织的靶向能力。如图3所示，由于透明质酸受体的存在，HA/PLL-RT/pDNA的内吞效率提升明显，进而可显著强化纳米颗粒的转染活性。为了实现与免疫治疗的协同作用，该递送系统装载shPD-L1形成HA/PLL-RT/ shPD-L1纳米颗粒。研究显示，该纳米颗粒在细胞层面可诱导PD-L1产生68.5%的表达下调程度。

图3 HA/PLL-RT/pDNA纳米颗粒的细胞层面表征

四、联合治疗的免疫学评估

Man-PLL-RT/OVA/CpG纳米疫苗和HA/PLL-RT/ shPD-L1纳米颗粒的联合治疗在活体实验中取得了显著的抗癌效果，为了深入分析这一联合治疗的抗癌机制，作者对肿瘤等组织进行了全面的免疫学评价。如图4所示，纳米疫苗单一治疗和联合治疗模式都能够显著增加CD11c+CD86+成熟树突细胞在淋巴结中的占比，表明纳米疫苗可在体内有效激活树突细胞。不仅如此，对肿瘤组织进行单细胞分析可知，联合治疗还能够直接诱导瘤内免疫细胞的活化，同时减少免疫抑制性细胞的活化、缓解肿瘤的免疫抑制性微环境。此外，联合治疗后活体血清中的促炎性细胞因子也得到了上调，与免疫细胞一道强化了免疫治疗的抗癌作用。

图4 联合治疗激活肿瘤免疫微环境

结论

在该项研究中，作者成功地制备了具有树突细胞靶向能力的纳米疫苗和肿瘤靶向能力的基因递送纳米颗粒。其中，纳米疫苗可有效地将抗原和佐剂递送到BMDCs，从而诱导细胞成熟、实现高效的抗原交叉呈递。此外，纳米疫苗还能够提升抗原在靶向淋巴结中的含量，从而激活胞内免疫功能。更重要的是，HA/PLL-RT/shPD-L1纳米颗粒作为基因递送系统可有效缓解肿瘤免疫耐受性微环境，因此可结合纳米疫苗发挥联合的免疫抗癌治疗。

文献链接：

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2452199X21002565#!

来源：高分子科学前沿

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